Une fois dans sa cellule hôte, le tachyzoïte se divise, au sein de la vacuole parasitophore, par un processus singulier appelé endodyogénie. Ce processus se caractérise par la formation de deux cellules filles à l’intérieur de la cellule mère. Deux parasites sont ainsi produits à chaque cycle mitotique en sept à dix heures selon les souches (Hu et al., 2002). Cette réplication se fait de manière quasi synchrone dans chaque vacuole parasitophore, donnant lieu à la formation de rosettes caractéristiques.
Même si l’endodyogénie a été décrite il y a 35 ans, le cycle cellulaire de T. gondii conduisant à sa réplication reste peu documenté.
1-Les différentes étapes de l’endodyogénie
L’endodyogénie est initiée par la formation de deux membranes pelliculaires formant l’IMC, qui sont synthétisées au milieu de la cellule mère et définissent les futures cellules filles. Pendant que cet IMC fils s’étend, la cellule mère devient plus sphérique alors que les organites apicaux se forment au niveau des deux pôles antérieurs des cellules filles et s’organisent soutenus par le cytosquelette de microtubules. L’enveloppe nucléaire reste toujours intacte tandis que le noyau, l’apicoplaste et une mitochondrie se divisent en deux et se répartissent entre les deux cellules filles (Black et Boothroyd, 2000).
Chaque cellule continue ensuite à maturer jusqu’à ce que le cytoplasme et l’ensemble de son contenu soient divisés entre les deux filles. Enfin, l’IMC du parasite parent est progressivement dégradé alors que le plasmalemme original contribue à la formation de l’enveloppe des deux nouvelles cellules. Les deux filles restent cependant attachées au niveau de leur pôle postérieur par un corps résiduel, ce qui explique la formation de rosettes au fur et à mesure de la réplication des parasites (Figure 29).
2-Les différentes étapes du cycle cellulaire : moyens d’étude,
comparaison et implications pour T. gondii
Le cycle cellulaire d’une cellule eucaryote se divise en quatre phases successives. Après la phase M, qui se compose d’une division nucléaire (mitose) et d’une division cytoplasmique, les cellules filles entrent en interphase d’un nouveau cycle. L’interphase débute avec la phase G1 pendant laquelle les activités biosynthétiques des cellules recommencent à une vitesse élevée. La phase S commence avec la synthèse d’ADN et se termine quand le noyau a doublé en ADN. Les cellules entrent ensuite en phase G2 qui se poursuit jusqu’au début de la mitose.
De façon générale, une méthode traditionnelle pour étudier le cycle cellulaire d’une cellule consiste à synchroniser la croissance cellulaire, par exemple en lui fournissant de la thymidine exogène. Cette thymidine est récupérée par la cellule grâce à une thymidine kinase qui la convertit en désoxythymidine monophosphate (dTMP), elle-même précurseur de la désoxythymidine triphosphate (dTTP) utilisée pendant la réplication. L’augmentation du pool de dTTP inhibe la ribonucléotide réductase, ce qui crée une déplétion du stock de cytosine, d’où un arrêt réversible du cycle cellulaire en phase G1. Une fois la thymidine exogène éliminée, les cellules reprennent leur cycle cellulaire de manière synchrone.
T. gondii ne possèdant pas de thymidine kinase, cette technique n’est pas utilisable dans ce système. Pour palier ce manque, Radke et White ont introduit le gène de la thymidine kinase du virus Herpes simplex dans certaines souches. Après traitement et chasse de thymidine, ils ont ainsi synchronisé une population de parasites et déterminé la durée de chaque phase du cycle cellulaire, en analysant le contenu en ADN des cellules. La phase G1 dure environ quatre heures, tandis que la phase S dure deux heures, et les phases G2 et M durent à elles deux moins d’une heure (Radke et White, 1998). Il en résulte que dans une population « asynchrone », 60% des parasites possèdent une quantité d’ADN de 1N, ce qui correspond à la phase G1, 30% sont en phase S (entre 1N et 2N ADN) et entre 5 et 10% ont 2N ADN et sont donc en phase G2/M (Radke et al., 2001).
3-Division cellulaire et évolution du contenu nucléaire
Pour mettre en relation les différentes étapes de la division cellulaire et de la réplication du matériel chromosomique, Hu et al. ont cloné dans T. gondii le gène codant une
protéine de l’IMC, IMC1, fusionné avec un gène rapporteur YFP (Hu et al., 2002). Ce marquage permet de visualiser la formation des IMC des cellules filles au cours de la division.
Ils ont ainsi mis en évidence que la duplication et la séparation des centrioles, ainsi que de l’appareil de Golgi étaient les événements les plus précoces morphologiquement reconnaissables de la division cellulaire. C’est à ce moment que la réplication de l’ADN est initiée (phase S). L’IMC des cellules filles s’organise progressivement avant la fin de la réplication de l’ADN. Une fois que cette réplication est achevée, le noyau s’allonge et se sépare en deux, puis les mitochondries sont divisées entre les deux cellules filles (Hu et al., 2002).
Il est particulièrement intéressant de noter que la perturbation des microtubules du parasite permet de découpler la division nucléaire et la division cytoplasmique, indiquant que les points de contrôle qui régulent la division cellulaire chez les autres eucaryotes sont probablement absents chez T. gondii ou s’articulent différemment (Morrissette et Sibley, 2002).
D. Objectifs et démarche expérimentale
L’objectif de cette étude est de caractériser plus précisément le défaut de développement précédemment observé chez les parasites surexprimant la forme active de la TgPP2C. L’analyse de la localisation subcellulaire de la TgPP2C dans les tachyzoïtes nous a conduits à nous focaliser sur le noyau. Nous avons donc cherché des substrats potentiels de la TgPP2C, responsables du phénotype observé. Pour ce faire, nous avons utilisé une construction codant pour la TgPP2C mais sous un promoteur moins fort, afin d’éviter un effet artéfactuel dû à une trop grande quantité de protéine. De plus, nous nous sommes servi d’un tag plus petit, permettant l’expression d’une protéine de taille plus proche de celle de la protéine endogène.
Cette nouvelle construction a permis d’une part, d’identifier un effet de la TgPP2C sur la division du noyau parasitaire, et d’autre part, de mettre en évidence la sécrétion d’une partie de la TgPP2C dans la cellule hôte.