Régulation de la stéroïdogénèse

a- Les effets de la FSH

Nos travaux confirment que l’activité stéroïdogènique est plus importante dans l’ovaire embryonnaire de poulet et qu’elle augmente au cours du développement tandis que celle-ci reste plus constante dans les testicules entre les jours 7 et 9. Nos travaux confirment également le rôle des gonadotropines et en particulier de la FSH dans la régulation de la stéroïdogénèse dans la gonade embryonnaire de poulet avec une voie de signalisation qui est fonctionnelle dès le début de la différenciation histologique de la gonade. D’autre part, ce travail confirme la plus grande sensibilité de la gonade femelle à la FSH due à une expression plus importante du récepteur à la FSH. De plus, l’expression de ce récepteur augmente au cours du développement ovarien induisant une augmentation de la sensibilité aux effets de la FSH. Ces données confirment les travaux d’Akazome et al. qui ont montré que le récepteur de la FSH était plus exprimé dans l’ovaire que dans le testicule et que son expression était plus forte au jour 12 qu’au jour 6 (Akazome et al., 2002). Chez les autres vertébrés, l’expression des récepteurs aux gonadotropines est également observée dès le début de la différenciation de la gonade comme chez les bovins (Wandji et al., 1992), les porcins (Goxe et al., 1993), le xenope (Urbatzka et al., 2010) ou le babouin (Zachos et al., 2003). Cependant, chez le rat, l’expression de FSHR n’apparait dans l’ovaire qu’après la naissance tandis qu’elle apparait dans le testicule au jour 15 du développement embryonnaire (Richards et al., 1979). D’autre part, chez le porc, FSHR et LHR sont plus exprimés dans le testicule embryonnaire que dans l’ovaire reflétant la mise en place des cellules de Leydig qui sécrètent une quantité plus importante de testostérone que l’ovaire où aucun follicule en croissance n’est retrouvé (Goxe

et al., 1993). Ainsi, la sensibilité aux hormones gonadotropes serait corrélée avec l’activité

stéroïdogène de la gonade embryonnaire comme chez le poulet où la production de stéroïdes est plus importante dans l’ovaire.

Au cours de nos expériences, nous avons montré l’augmentation de la sensibilité à la FSH pendant la différenciation ovarienne, conséquence d’une expression plus importante de

FSHR mais sans influence de la FSH elle-même sur cette expression. Pourtant, suite à une

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d’expression du récepteur à la FSH et à la LH aux jours 9 et 13 (Sanchez-Bringas et al., 2006) suggérant une régulation des récepteurs par les hormones gonadotropes. Ces résultats sont néanmoins à moduler par le fait qu’ils n’aient pas été obtenus par PCR en temps réel et ne sont donc pas quantitatifs. Cependant, la FSH augmentant la prolifération des cellules ovariennes (Velazquez et al., 1997; Mendez-Herrera et al., 1998; Pedernera et al., 1999), la diminution de l’expression du récepteur après adénohypophysectomie pourrait être une conséquence de la diminution du nombre de cellules. Or lors des études des effets de la FSH sur la prolifération dans les cultures de gonades embryonnaires dissociés, les effets sur la prolifération cellulaire sont visibles dès 60h de culture. Nous envisageons de vérifier si dans le cadre des cultures organotypiques, les effets de la FSH sur la prolifération sont également retrouvés. D’autre part, chez les mammifères, la FSH et les œstrogènes agissent en synergie pour stimuler l’expression de FSHR en augmentant le nombre de cellules de granulosa. De manière similaire, chez le poulet, les œstrogènes pourraient par l’augmentation de la prolifération augmenter les niveaux de FSHR. Néanmoins, dans les cultures de cellules ovariennes de poulet au jour 18, l’ajout de 17β-œstradiol ne modifie par les niveaux de prolifération (Velazquez et al., 1997). Ces expériences ayant étés réalisés uniquement à ce stade tardif, cela n’exclut pas un rôle mitogène des estrogènes à des stades antérieurs.

Dans les cellules de granulosa des poules adultes, plusieurs voies de signalisation de la FSH ont été identifiées. Comme chez les mammifères, les effets de la FSH sur l’augmentation de l’expression et de l’activité de STAR et sur l’augmentation de la production de P4 sont médiés par l’activation de la voie AMPc/PKA (Johnson et al., 2001). D’autre part, l’activation de la voie des MAPK (mitogen activated kinase-like protein) via l’activation de EGFR (epidermal growth factor receptor) (Johnson et al., 2001) ainsi que l’activation de la voie PKC (Woods et al., 2007a; Woods et al., 2007b) supprime les effets de la FSH sur la synthèse protéique de STAR et sur la production de la progestérone par les cellules de granulosa indifférenciée tandis qu’au cours du développement folliculaire, les deux voies deviennent stimulatrices de l’expression de STAR et de la production de P4 (Woods et al., 2007a). D’autre part, les effets prolifératifs de la FSH sur les cellules ovariennes embryonnaires de poulet sont médiés par l’activation de la PKT (Peralta et al., 2009).

Nous envisageons de poursuivre ces travaux sur le rôle de la FSH au cours de la différenciation gonadique chez le poulet, par l’investigation de ces différentes voies.

b- Les effets de BMP4

Cette étude sur le rôle de BMP4 dans la gonade embryonnaire de poulet est la première à montrer une voie fonctionnelle des BMPs dès le début de la différenciation de la gonade que ce soit chez le mâle ou chez la femelle. Néanmoins, lors de ces expériences, il a été utilisé une protéine recombinante humaine présentant 84% d’identité de séquence avec la protéine de poulet ; l’utilisation d’un système hétérologue pourrait expliquer en partie la variabilité observée dans les réponses à BMP4 et il est possible que les effets observés seraient plus marqués en utilisant un système homologue. Cependant, BMP4 semble être un régulateur de la production basale et induite par la FSH de la progestérone via une régulation des gènes STAR et CYP11A1 et en absence d’effet sur l’expression du récepteur à la FSH. Dès lors, BMP4 pourrait agir en régulant l’activité de l’adénylate cyclase induite par la FSH comme c’est le cas chez les mammifères (Pierre et al., 2004; Knight et al., 2006). De plus, la signalisation des BMPs et de la FSH utilise également la voie des MAPK dans les cellules de granulosa des mammifères (Moore et al., 2001; Dewi et al., 2002; Yu et al., 2005; Miyoshi et

al., 2007). Cependant, ces BMPs sont potentialisateur des effets de la FSH sur la

phosphorylation de P38 et par ce biais stimulateur de la production d’œstradiol par les cellules de granulosa de rat (Inagaki et al., 2009). De plus, l’inhibition de la phosphorylation de Erk1/2 surprime les effets mitogènes de BMP15 sur ces cellules sans affecter la production de progestérone (Moore et al., 2003). Néanmoins, l’investigation de l’implication de ces différentes voies dans notre modèle pourrait permettre de mieux comprendre l’action des BMPs et pourrait permettre de déterminer si par ce biais les BMPs peuvent réguler les effets de la FSH.

De plus, la stimulation importante par la FSH et l’inhibition par BMP4 de la production de progestérone, nous amène à nous interroger sur l’importance de ce stéroïde au cours de la mise en place de l’ovaire chez le poulet. Lors de la première étude, nous avons montré que l’ovaire comme le testicule embryonnaire de poulet exprimaient le récepteur à la progestérone (PR) suggérant une action paracrine de ce stéroïde. De façon similaire à l’ovaire de poulet, l’ovaire embryonnaire de rat ne possède pas de follicules qui se mettent en place après la naissance (les ovocytes étant organisés en nids) et sécrètent des niveaux importants de P4 (Kezele et al., 2003).

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Figure 15 : Effets des différents membres de la famille du TGFβ sur l’activité transcriptionnelle de FOXL2 dans les cellules de granulosa de brebis.

Les cellules de granulosa de petits follicules à antrum de brebis sont cultivées pendant 24h avec 5% de sérum ovin fœtal. Ces cellules sont ensuite transfectées avec la construction promoteur-luciférase (CYP19A1 ou STAR) associée à un plasmide exprimant ou non FOXL2. Pour chacune de ces associations, les cellules sont traitées pendant 48h avec ou sans BMP4 (50ng/ml), Activine-A (50ng/ml) ou TGFβ1 (5ng/ml). Les lettres différentes indiquent les effets significatifs de l’expression de FOXL2 sur l’activité luciférase pour chacune des conditions de traitement (p<0.05). Les astérisques indiquent les effets significatifs des traitements sur les activités luciférase (* p<0.05 ; ** p<0.01 ; *** p<0.001).

Lors de culture d’ovaires de rats prélevés à la naissance (J0), l’ajout de P4 inhibe la formation des follicules primordiaux et la transition de ces follicules en follicules primaires (Kezele et al., 2003). Ainsi, nous pouvons émettre l’hypothèse que la P4 jouerait un rôle similaire dans l’ovaire embryonnaire de poulet en retardant la mise en place de l’organisation folliculaire.

Outre son effet sur la progestérone, nous avons montré que BMP4 était un inhibiteur de la synthèse de l’œstradiol par inhibition de l’expression transcriptionnelle et traductionnelle de l’aromatase. Ainsi, BMP4 qui est un facteur plus exprimé dans l’ovaire ne semble pas être un facteur qui promeut le développement ovarien. D’autre part, nous avons étudié les effets de BMP4 sur l’expression de FOXL2 dont la protéine est impliquée chez les mammifères dans l’inhibition de l’expression du gène STAR et dans la stimulation de celle de

CYP19A1. Or nous avons observé des effets inhibiteurs de BMP4 sur l’expression de ces deux

gènes sans modification de l’expression de FOXL2. Outre une action sur l’expression de ce gène, la signalisation des BMPs pourrait moduler l’activité de ce facteur de transcription sur les promoteurs de ses gènes cibles. Cependant, dans les cultures de cellules de granulosa de petits follicules à antrum de brebis cycliques, si BMP4 seul est inhibiteur de l’activité du promoteur de CYP19A1, il ne modifie pas l’activité stimulatrice de FOXL2 sur ce promoteur (Figure 15) (données non publiées obtenues lors de mon stage de MII sous la direction de S.Fabre) et de façon similaire BMP4 ne modifie pas l’inhibition exercée par FOXL2 sur l’expression de STAR. Ces données renforcent l’idée que l’action de BMP4 sur la transcription des gènes de l’aromatase et de STAR est indépendante de l’action de FOXL2.