Régulation de l’inhibiteur p27 Kip1 par la cathepsine B dans les cellules cancéreuses

L’inhibiteur p27Kip1 _{participe aucontrôle de la sortie de la quiescence et de l’entrée}

des cellules dans le cycle cellulaire. En réponse à une stimulation mitogénique, p27Kip1 _{est dégradé, facilitant l’activation des complexes cyclines D/cdk4,6 et}

cycline E/cdk2 et par conséquent, la progression à travers la phase G1 et l’entrée en phase S (Rivard et al., 1999; Takuwa and Takuwa, 1997). Deux mécanismes majeurs de dégradation de p27Kip1 _{impliquant le protéasome ont été}

antérieurement décrits. En phase G1 précoce, la protéine p27Kip1 _{est dégradée}

dans le cytoplasme par le complexe promoteur d’ubiquitination KPC (Kip1 ubiquitination-promoting complex) (Hara et al., 2001; Kamura et al., 2004). Lors de

la transition G1/S et lors de la phase G2, p27Kip1 _{est dégradé dans le}

compartiment nucléaire par le complexe d’ubiquitination SCFSKP2 _{(Nakayama et}

al., 2004). Mise à part ces deux mécanismes protéasome-dépendants, peu de choses est connu concernant la dégradation de p27Kip1 _{dans le contexte}

tumorigénique. Certaines dégradations indépendantes du protéasome ont été aussi décrites concernant p27Kip1_{. Par exemple, dans les méningiomes}

choroïdaux, p27Kip1 _{peut subir une dégradation dépendante d’une cystéine}

protéase de type calpaïne et ce, dépendamment de l’activité MAP kinase (Delmas et al., 2003). Un clivage caspase-dépendant de p27Kip1 _{a été aussi rapporté dans}

la lignée de myélome humain U266 en condition de blocage du cycle en phase G1 précoce. Ce clivage génère un fragment p23 qui est séquestré dans le cytoplasme ; cependant, p27Kip1 _{conserve ses qualités d’inhibiteur puisque son}

domaine de liaison aux complexes CDK/cycline reste intact (Loubat et al., 1999). De manière intéressante, une petite portion de p27Kip1 _{a été retrouvée dans les}

lysosomes des cellules Hela, NIH-3T3 et COS7 ce qui suggère là aussi que le protéasome n’est pas le seul compartiment de dégradation de p27Kip1_{. L’utilisation}

d’un inhibiteur d’activité protéasique lysosomale tels que la leupeptine ou encore un perturbateur du pH lysosomal comme la chloroquine augmente les niveaux de p27Kip1 _{suggérant que cet inhibiteur pourrait être en partie dégradé dans les}

cette dégradation lysosomale n’a pas été identifiée dans cette étude. Par ailleurs, nos expériences d’immuno-localisation de la cathepsine B et de p27Kip1 _nous

révèlent que ces deux protéines colocalisent dans des vésicules de type endolysosomale dans les cellules cancéreuses colorectales Caco-2/15. Des expériences de double hybride chez la levure à partir d’une librairie d’ADN complémentaires de cellules Caco-2/15 nous avaient déjà suggéré l’interaction directe entre l’inhibiteur p27Kip1 _{et la cathepsine B (résultats non publiés de Jim}

Boulanger). Rappelons aussi que mes résultats obtenus chez les souris nues ont montré des niveaux de p27Kip1 _{augmentés dans les tumeurs sous-cutanées}

formées à partir de cellules HT-29 sous-exprimant la cathepsine B. Prises ensemble, ces observations suggèrent qu’un mécanisme de dégradation de p27Kip1 _{implique la cathepsine B dans le contexte tumoral colorectal. En accord}

avec cela, nos expériences _{in vitro de dégradation de p27}Kip1 _{par la cathepsine B}

recombinante démontrent que cette protéase a effectivement la capacité de cliver p27Kip1 _{et de générer deux fragments majoritaires très précocement. Par ailleurs, il}

est important de noter que dans ces expériences de clivage de p27Kip1 _nous

n’observons jamais de disparition totale de la forme pleine longueur de p27 au profit des fragments de clivages. Les quantités de substrats p27Kip1 _{utilisées sont}

sans doute en excès par rapport aux quantités d’enzymes. Cependant, quelles que soit les conditions, la présence constante des deux fragments p10 et p20 renforce une spécificité de clivage par la cathepsine B. Plusieurs expériences ont été tentées pour confirmer de manière claire l’interaction de p27Kip1 _{avec la forme}

pleine longueur de la cathepsine B qui est majoritairement lysosomale. Cependant, par immunoprécipitation de p27Kip1 _{dans les cellules 293T}

surexprimant les deux protéines, les signaux correspondant à la cathepsine B sont masqués par la présence des chaines d’immunoglobulines utilisées lors de l’immunoprécipitation. En revanche une colocalisation des deux protéines a été possible par immunofluorescence en microscopie confocale dans les cellules cancéreuses Caco2/15. Enfin, l’identification des sites putatifs de clivage de p27Kip1 _{par la cathepsine B a permis de générer par clonage une forme double}

à la cycloheximide (CHX) dans les cellules 293T surexprimant les deux formes de p27Kip1 _{ont montré que cette forme mutante pour les sites de clivage de la}

cathepsine B possède une stabilité augmentée par rapport à la forme sauvage. De plus, certaines données préliminaires concernant la fonctionnalité du double mutant p27Kip1 _{par des expériences d’essais kinase sur des substrats de CKD2,}

nous suggèrent que ce double mutant conserve ses capacité à inhiber les complexes de cyclines associées à CDK2. Pour résumer, nos résultats supportent l’hypothèse selon laquelle différentes fractions de p27Kip1 _{seraient amenés à être}

clivées par des formes alternatives de cathepsine B selon leurs localisations nucléaires et/ou lysosomales. Non seulement les données de digestion de p27Kip1

ainsi que sa fine colocalisation lysosomale suggèrent que ces portions sont clivées par la forme traditionnelle pleine longueur de la cathepsine B au sein des lysosomes. Mais aussi il n’est pas à exclure que la forme ctsB (-2/-3) puisse être à l’origine d’un clivage nucléaire de l’inhibiteur p27Kip1_{. Il a déjà été montré que}

certains facteurs nucléaires peuvent être clivés par des cathepsines nucléaires ou associées aux membranes externes des noyaux (Boudreau et al., 2007; Goulet et al., 2004; Tedelind et al., 2011; Tedelind et al., 2010). Cependant, dans le cas de délocalisation des cathepsines, le changement de pH peut amener des modifications de leur spécificité de clivages. Une réduction de leur activité globale peut aussi être observée (Goulet et al., 2004).

5 CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES