Régulation des FOXO par la voie Ryk

Les voies développementales peuvent jouer un rôle dans la survie des cellules adultes. Cependant, si elles interagissent avec les voies de longévité et survie cellulaire pour conférer une protection contre la toxicité liée aux maladies neurodégénératives, ce type de mécanisme reste mal compris. Des études ont montré une interaction possible entre les voies Wnt et les facteurs de transcription FOXO, conduisant à une protection des cellules contre la toxicité induite par le stress cellulaire. En effet, l’inhibition de la dé-acétylase SIR2/SIRT1 impliquée dans la régulation de DAF16/FOXO3 et de sa cible daf16/FOXO3, protège du déclin et d’une motilité anormale, les cellules musculaires chez un modèle C. elegans présentant une répétition polyQ. La neuroprotection induite par la dé-acétylation de FOXO3 par SIRT1 passerait par la voie Wnt-β-caténine dépendante (Pasco et al., 2010). D’autres études plus récentes révèlent l’importance du facteur de transcription FOXO3 dans la progression du cancer de la prostate (Liu et al., 2015a). FOXO3 inhibe de manière significative l’expression de β-caténine dans les cellules cancéreuses de la prostate (Liu et al., 2015a). En se liant directement à la β-caténine, FOXO3 entre en compétition avec TCF pour l’interaction avec la β-caténine, inhibant ainsi l’activité transcriptionnelle du complexe TCF/β-caténine et réduisant ainsi l’expression des gènes cibles de TCF.

3.1. Wnt, voie de signalisation développementale

3.1.1. Complexité de la voie Wnt

Les protéines Wnt sont une famille de glycoprotéines hautement conservées, riches en cystéines, d’environ 350 acides aminés, sécrétées dans le milieu extracellulaire, qui influent sur le destin des cellules voisines dans plusieurs organes. La voie de signalisation Wnt est impliquée dans une variété de processus développementaux, y compris la détermination du destin cellulaire, la polarité cellulaire, la structure des tissus, le développement embryonnaire, le maintien des cellules souches, le contrôle de la prolifération cellulaire et le maintien de l’homéostase tissulaire adulte (Yamaguchi et al., 1999; Moon et al., 2002). Chez l’Homme, on dénombre 19 protéines Wnt (Kikuchi et al., 2011).

Ces voies ont été classées comme étant canoniques (β-caténine-dépendante) ou non-canonique (β-caténine-indépendante). Toutefois, cette classification ne peut servir qu’à titre indicatif, puisque des voies de signalisation Wnt canonique et non-canonique sont utilisées dans des contextes cellulaires différents (Simons and Mlodzik, 2008; Kikuchi et al., 2011; Clark et al., 2012). Bien que plusieurs voies Wnt activent préférentiellement soit les voies β-caténine-dépendantes ou β-caténine indépendantes, l’activité de Wnt dépend du contexte cellulaire et du récepteur et, par conséquent, elles ne peuvent pas être subdivisées rigoureusement selon la signalisation qu’elles induisent. Il existe plus de 15 récepteurs et co-récepteurs différents des protéines Wnt et c’est la combinaison particulière d’un récepteur/co-récepteur avec un ligand Wnt donné qui détermine la voie activée en aval.

La complexité de la voie de signalisation intracellulaire Wnt est parallèle à la complexité observée dans la diversité des récepteurs Wnt. Les récepteurs Wnt comprennent i) la famille des récepteurs Frizzled (FZZ), ii) les récepteurs Low Density Lipoprotein Receptor-related Proteins-5/6 (LRP-5/6), iii) les récepteurs tyrosin kinase-like Receptor-1 Orphan / 2 (ROR1 / 2), et iv) les récepteurs liés à la tyrosine (Y) kinase (Ryk).

Les récepteurs Frizzled sont des récepteurs couplés aux protéines G à sept domaines transmembranaires. Cette famille de récepteurs comprend au moins dix membres différents qui transduisent des effets tissus-spécifiques. La structure des membres de la famille Frizzled est similaire : ils présentent un signal peptidique divergent sur l’extrémité N-terminale, un domaine extracellulaire riche en cystéines hautement conservé, une région de liaison de longueur variable, une région à sept domaines transmembranaires, et une extrémité C-terminale de longueur variable. Les ligands Wnt se lient aux récepteurs Frizzled par le domaine cellulaire riche en cystéine, et peuvent également nécessiter un co-récepteur, comme LRP-5, LRP-6, ROR, ou Ryk, pour l’activation des voies de signalisation en aval.

LRP-5 et 6 sont des orthologues du récepteur Arrow chez la drosophile, et sont associés à la voie de signalisation canonique β-caténine-dépendant. ROR 1/2 et Ryk sont des co-récepteurs de Wnt supplémentaires qui sont associés à la voie non-canoniques de Wnt. Les ligands Wnt ont des affinités différentes pour les différents récepteurs Frizzled, l’activation d’une cascade de signalisation est donc dépendante du ligand et du contexte d’interaction cellulaire (Figure 23).

Figure 23 : Voies de signalisation Wnt. Schéma simplifié des principales voies Wnt suite à une interaction spécifique entre un ligand Wnt, Frizzled et un co-récepteur. (a) La voie de signalisation de la polarité cellulaire planaire (PCP) déclenche l’activation des petites GTPases RHOA et RAC1, qui à leur tour activent la RHO kinase (ROCK) et la c-jun-N-terminal kinase (JNK), respectivement, conduisant à la polymérisation de l’actine et de la stabilisation des microtubules. Cette voie est principalement impliquée dans la régulation de la polarité cellulaire, la motilité cellulaire et les mouvements morphogénétiques. (b) La voie β-caténine-dépendant : Dans des conditions cellulaires stables, GSK3 (glycogen synthase kinase 3) phosphoryle la β-caténine, ce qui déclenche sa dégradation. Cependant, en présence d’un ligand Wnt, le complexe de dégradation comprenant GSK3, CKIα, Axine et APC est recruté par le complexe ligand Wnt/récepteur et inactivé. Ceci entraîne l’accumulation de la β-caténine dans le cytoplasme et sa translocation dans le noyau où elle active la transcription de gènes cibles sous le contrôle du facteur de cellule T (TCF), entre autres. (c) La voie Wnt-Ca2+ active CAMKII (Ca2 + et calmoduline-kinase II dépendante), PKC (protein kinase C) et la calcineurine. La calcineurine active le facteur nucléaire des lymphocytes T activés (NFAT), qui régule la transcription de gènes contrôlant le destin des cellules et la migration cellulaire. Les voies de signalisation PCP et Ca2+ antagonisent la signalisation de la β-caténine à différents niveaux. (d) Sont décrits ci-dessus les principales voies utilisées par les récepteurs et co-récepteurs Wnt. Pour les autres récepteurs, nous détaillerons uniquement le récepteur Ryk dans le paragraphe Voie Ryk-ICD (DAAM, DVL‐associé activateur de la morphogenèse 1; DVL-Dishevelled; LRP-low‐density lipoprotein receptor‐related protein; MUSK-muscle skeletal receptor Tyr kinase; PLC-phospholipase C; PTK7-protein Tyr kinase 7; ROR, receptor Tyr kinas‐like orphan receptor; RYK, receptor Tyr kinase) (Niehrs, 2012).

3.1.2. β-Caténine, effecteur de la voie Wnt

La β-caténine est une protéine d’environ 88k Da et appartient à la famille des protéines dites « armadillo », caractérisées par un motif central composé de 42 acides aminés présentant une répétition du domaine « armadillo ». Par sa présence dans les différents compartiments cellulaires, la β-caténine est une protéine multifonctionnelle en fonction de sa localisation sub-cellulaire. Au niveau membranaire, elle a un rôle dans l’adhésion cellulaire, la signalisation cellulaire et la transcription des protéines. Par sa liaison avec les cadhérines et l’α-caténine, c’est un constituant des adhésions focales. Son rôle est important dans l’adhésion intercellulaire notamment au niveau neuronal. Elle participe à la plasticité neuronale synaptique et à la régulation synaptique (Maguschak and Ressler, 2012). Au niveau nucléaire, la β-caténine joue un rôle central de co-activateur transcriptionnel notamment impliqué dans la direction de plusieurs processus développementaux en se liant directement aux facteurs de transcription tels que TCF ou FOXO3.

La plupart des interactions avec la β-caténine nécessitent les répétitions « armadillo » et certaines études suggèrent que la phosphorylation des protéines qui interagissent avec la β-caténine entraîne l’apparition d’une partie protéique chargée négativement, ce qui renforce la liaison au domaine « armadillo » de la β-caténine chargée positivement (Xu and Kimelman, 2007). Il faut cependant noter que toutes les phosphorylations ne conduisent pas à une plus forte interaction avec la β-caténine ; plusieurs événements de phosphorylation ont été décrits comme diminuant l’affinité de liaison avec la β-caténine. En effet, aux extrémités N-terminale et C-terminale de la β-caténine, on retrouve des régions régulatrices non structurées qui sont largement impliquées dans le recrutement de cofacteurs pour l’adhésion et l’activation transcriptionnelle. Enfin la β-caténine est un effecteur important de la voie Wnt canonique.

3.2. Voies de signalisation Wnt

3.2.1. Signalisation Wnt canonique

La signalisation Wnt est initiée par la formation du complexe entre un ligand Wnt, le récepteur Frizzled et son corécepteur. L’extrémité C-terminale intracellulaire de Frizzled peut se lier directement (et faiblement), au domaine PDZ (Postsynaptic density-95, Discs-large and Zonula occludens-1) de Dishevelled (DSH) (Wong et al., 2003). La liaison de Wnt à ses récepteurs entraîne donc l’activation de DSH ce qui contrecarre l’activation du complexe de dégradation de la β-caténine (Cadigan and Liu, 2006; Li and Zhan, 2006). La dégradation de la caténine est initiée par un complexe multiprotéique comprenant quatre protéines : la

β-caténine, la sérine/thréonine kinase GSK3β (glycogène synthase kinase-3β), le produit du gène suppresseur de tumeur APC (adenomatous polyPosis coli) et les protéines de la famille axine/conductine (Barker et al., 2000; Harwood, 2002; Kimelman and Xu, 2006). Lors de la formation du complexe de dégradation, la β-caténine est phosphorylée à son extrémité N-terminale par GSK3β (Ser33 et Ser37) et par CK1 (Ser45). Ces sites de phosphorylations servent de sites de reconnaissance pour l’E3 ubiquitine-ligase β-TrCP. Il en résulte une polyubiquitinylation de la β-caténine et sa dégradation par le protéasome (McManus et al., 2005).

La voie de signalisation Wnt permet de contrôler la biodisponibilité de la β-caténine dans le cytoplasme. Toute accumulation cytoplasmique se traduit par la translocation de la β-caténine dans le noyau où elle peut alors se lier à divers facteurs de transcription tels TCF (Facteur de Lymphocyte T) ou encore FOXO3 (Essers et al., 2005b; MacDonald et al., 2009) (Figure 24).

Figure 24 : Voie de signalisation Wnt/β-caténine canonique. La liaison de la protéine Wnt initie une cascade de signalisation qui conduit à l’activation de la β-caténine, son accumulation dans le cytoplasme et sa translocation dans le noyau et la transcription de gènes cibles (à gauche). Lorsque les récepteurs Fzz/LRP ne sont pas engagés, CK1 et GSK3B phosphorylent séquentiellement la caténine liée à l’axine. Par conséquent, la β-caténine est ubiquitinylée et ciblée par le protéasome pour une destruction rapide (à droite) (Vilchez et al., 2016).

Une activation anormale/oncogénique de la voie Wnt, par exemple par la perte de l’APC, conduit à une β-caténine constitutivement active qui favorise et prolonge l’activation des gènes cibles en aval, notamment le gène MYC, un oncogène, impliqué dans la prolifération cellulaire (van de Wetering et al., 2002) ce qui peut être lié à l’apparition de cancer (Beaulieu, 2015). La HTT participe aussi à stabilisation du complexe de dégradation de la β-caténine ce qui entraine une dégradation équilibré de la β-caténine. La stabilisation

du complexe est altérée par la présence de la mHTT ce qui contribue à une accumulation toxique de β-caténine (Godin et al., 2010).

3.2.2. Signalisation Wnt non-canonique

La signalisation Wnt β-caténine-indépendante englobe les voies qui n’utilisent pas un module β-caténine/TCF ou un module β-caténine/LEF mais utilisent d’autre voies de signalisation en aval, dont certaines provoquent une réponse transcriptionnelle. Il existe maintenant un ensemble confus de ces voies de Wnt non-canoniques, classées selon les récepteurs et/ou co-récepteurs utilisés et les voies effectrices activées en aval.

i) Voie non-canonique PCP

La voie β-caténine-indépendante la mieux caractérisée est la voie de PCP. Les éléments transmembranaires à la base de la voie PCP comprennent le récepteur FZZ, le récepteur transmembranaire VANGL et la cadhérine, Flamingo. Les protéines cytoplasmiques de base sont DSH, Prickle ou Diego. Flamingo peut recruter soit FZZ ou VANGLE, et ensuite recruter DSH et Prickle (Zallen, 2007). DSH interagit de manière compétitive avec Prickle et Diego. Alors que Diego favorise la signalisation FZZ par DSH, Prickle l’inhibe. Ces composants PCP de base sont souvent asymétriquement localisées dans les cellules. Ainsi, en fonction de la localisation de ces composants, la voie PCP peut être activée ou inhibée sur certains sites au sein d’une cellule.

Les récepteurs FZZ activent une cascade qui implique les petites GTPases (RAC1/ RhoA) et c-Jun N-terminal kinases (JNK). Cette voie peut conduire à des changements dans le cytosquelette et la polarité cellulaire par l’intermédiaire de petites GTPases et/ou l’activation transcriptionnelle de facteurs de transcription JNK-dépendant, par exemple ATF2 (Activating transcription Factor 2), avec activation simultanée de leur gènes cibles (Simons and Mlodzik, 2008; Kikuchi et al., 2011). La voie PCP est largement impliquée dans la régulation de la polarité cellulaire au cours des processus morphogénétiques. Chez les vertébrés, la voie PCP régit le mouvement des cellules durant la gastrulation, la fermeture du tube neural et l’orientation des stéréocils dans l’oreille interne (Simons and Mlodzik, 2008; Kikuchi et al., 2011). La voie PCP et la voie Wnt dépendante de la β-caténine sont bien connues pour être antagonistes l’une de l’autre, et ainsi l’inhibition de l’une entraînera la régulation à la hausse de l’autre.

ii) Voie non-canonique Wnt- Ca2+

La seconde voie de signalisation β-caténine indépendante est la voie Wnt-Ca2+ qui a été initialement identifiée dans les embryons de X. laevis et de zebrafish (Slusarski et al.,

1997). Dans ce cas, les ligands Wnt, en se fixant à Fzz, déclenchent l’activation des protéines G hétérotrimériques ce qui conduit à l’activation de la phospholipase C (PLC). La PLC stimule à son tour la production de diacylglycérol et d’inositol-1,4,5-triphosphate et déclenche libération de Ca2+ des réserves intracellulaires et induit l’activation d’effecteurs tels que CAMKII, la calcineurine et la protéine kinase C (PKC), qui activent NFAT (facteur de transcription nucléaire associé régulateur aux des cellules T). Cette voie est impliquée dans le cancer, l’inflammation et la neurodégénération (De, 2011).

Outre ces deux voies β-caténine-indépendantes, il existe des événements tissus-spécifiques supplémentaires déclenchés par les ligands Wnt en combinaison avec Frizzled ou des co-récepteurs spécifiques qui ne tombent pas dans ces catégories dont une voie qui nous intéresse particulièrement et sera discutée ci-dessous et plus particulièrement au cours des chapitre 2 et 3 : la voie Ryk-ICD/FOXO3/β-caténine.

3.2.3. Voie Ryk-ICD

Longtemps considéré comme un récepteur orphelin, Ryk est devenu, en seulement quelques années, le sujet de nombreuses recherches. L’identification de Ryk comme co-récepteur des protéines Wnt (Eisenmann, 2005) a été un des éléments déclencheurs de ces recherches. En effet, ce récepteur atypique est impliqué dans plusieurs processus développementaux comme la formation de la vulve chez C. elegans (Deshpande et al., 2005), la neurogenèse corticale (Lyu et al., 2008b), le guidage axonal et la synaptogenèse chez les mammifères (Bovolenta et al., 2006), avec aussi un rôle supposé dans l’inhibition de la régénération axonale (Liu et al., 2008b).

Figure 25 : Structure du récepteur Ryk. Ryk contient dans sa partie intracellulaire, un domaine RTK catalytiquement actif bien que la présence de plusieurs substitutions d’acides aminés sur ce domaine ait longtemps fait penser le contraire. La liaison avec les ligands Wnt s’effectue au niveau du domaine WIF, situé dans la partie extracellulaire du récepteur. Ryk (75kDa) possède aussi deux sites de clivage : l’un situé dans le domaine extracellulaire du récepteur et responsable de la libération d’un fragment de 45 kDa appelé CTF (C-Terminal Fragment), l’autre situé dans la partie transmembranaire du récepteur, est clivé par le complexe gamma-sécrétase, libérant le domaine intracellulaire de Ryk (Ryk-ICD) de 42kDa. Enfin, Ryk possède un domaine de liaison aux protéines à domaine PDZ dans sa région carboxyterminale. TYRKC, Tyr kinase catalytic domain; WIF, Wnt-inhibitory factor-1 like domain (Niehrs, 2012).

Ryk (Receptor Tyrosine Kinase-related ) est un récepteur transmembranaire de la famille des récepteurs tyrosine kinase (Hovens et al., 1992) qui se lie à Wnt (aussi connu sous le nom Derailed (DRL) chez D. melanogaster) (Yoshikawa et al., 2003; Lu et al., 2004). C’est un récepteur à un seul domaine transmembranaire (Halford and Stacker, 2001) dont le domaine extracellulaire contient un module WIF (WNT-inhibitory factor-1 like domain) qui permet la liaison des ligands Wnt à Ryk (Lu et al., 2004). En plus de la liaison aux ligands Wnt, Ryk peut également interagir directement avec FZZ (Hsieh et al., 1999) ce qui suggère que Ryk agit également comme un co-récepteur de Wnt (Figure 26). Cette protéine est très conservée au travers des espèces, avec un gène Ryk chez les mammifères, zebrafish et C. elegans et trois orthologues chez la drosophile (Fradkin et al., 2010). Ryk est impliqué dans les voies de signalisation β-caténine-dépendante, la voie PCP et la voie Ca2+-dépendante (Lu et al., 2004; Berndt et al., 2011; Macheda et al., 2012).

i) Implication de Ryk dans la voie β-caténine-dépendante

Il y a de nombreuses interaction entre Ryk et la β-caténine qui participent à la modulation des voix de signalisation β-caténine-dépendante :

L’activation de DSH par FZZ peut se produire de manière indirecte et être médiée par Ryk (Lu et al., 2004). Ryk et DSH sont liées dans les cerveaux de souris et leur co-expression dans des cellules HEK 293T (Human Embryonic Kidney 293T) conduit à une augmentation de l’activation de la voie TCF (Lu et al., 2004). L’interaction entre Dishevelled et Ryk est éliminée par une mutation du domaine PDZ de Dishevelled, et la suppression endogène de Dishevelled supprime l’activation de la voie TCF médiée par Wnt3a.

Les pertes de fonction de lin18/RYK mènent à l’impossibilité pour le ligand Wnt3a d’activer les gènes sous le contrôle de la β-caténine. (Lu et al., 2004). De plus, Ryk est ubiquitynilé par l’E3 ubiquitine-ligase Mind Bombe 1 (MIB1) ce qui réduit son niveau à la membrane plasmique. Cette diminution de Ryk à la membrane conduit à la répression des gènes liée à une activité β-caténine dépendante (Berndt et al., 2011) ce qui suggère un lien entre Ryk et la β-caténine. En effet le fragment Ryk-ICD peut se lier à la β-caténine, réprime ses effets de co-facteur. Nous détaillerons cela dans la partie iii.

ii) Implication de Ryk dans la voie PCP

Ryk est un impliqué dans la voie de signalisation Wnt/PCP, il active RhoA, un effecteur en aval de la signalisation PCP (Macheda et al., 2012). L’analyse détaillée de deux organismes modèles vertébrés a montré que des phénotypes Ryk étaient compatibles avec la signalisation PCP. Chez le poisson zèbre, l’inactivation de ryk a révélé une interaction entre Ryk et Wnt11 au cours du processus de l’extension des embryons régulé par la voie

régulée PCP (Macheda et al., 2012). Des embryons de souris déficients en ryk présente une perturbation de polarité des stéréocils, un phénotype associé à un dysfonctionnement de la signalisation PCP. Cette perturbation est médiée par une interaction entre Ryk et VANGL2 qui forme un complexe protéique (Andre et al., 2012; Macheda et al., 2012).

iii) la voie Ryk-ICD

L’activité de Ryk est aussi médiée par son fragment intracellulaire Ryk-ICD. Le fragment Ryk-ICD est issu du clivage de Ryk par les gamma-sécrétases. Ce clivage permet la libération du fragment Ryk-ICD dans le cytoplasme et la translocation de Ryk-ICD dans le noyau avec notamment un rôle dans la différenciation des cellules souches neurales en réponse à une stimulation par les ligands Wnt (Lyu et al., 2008b). Le domaine intracellulaire Ryk-ICD est stabilisé dans le cytoplasme par Cdc37 (Lyu et al., 2009) et les ligands Wnt comme Wnt3a favoriseraient la translocation nucléaire de Ryk-ICD (Lyu et al., 2008b). Les effets transcriptionnels du fragment Ryk-ICD et ses mécanismes de translocation sont inconnus à ce jour. Nous verrons dans la partie III que Ryk peut se lier à la β-caténine et qu’il forme avec FOXO3 et la β-caténine, un complexe tripartie. Nous étudierons les effets potentiels de la formation de ce complexe sur la régulation de gènes considérés comme cibles de FOXO3 et dépendants ou non de la mHTT.

Chapitre 4 - Cellules Souches Humaines et