La SRM est actuellement la méthode incontournable pour la quantification ciblée, absolue ou relative, mais présente certaines limites en termes de capacités de multiplexage, de sensibilité ou encore de spécificité (Picotti and Aebersold, 2012).
Les capacités maximum de multiplexage sont aujourd’hui limitées à 1000 et 6000 transitions par heure, correspondant à 100 et 750 protéines, respectivement pour la scSRM et la iSRM. Cette capacité est dépendante de l’optimisation des
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conditions chromatographiques (voir paragraphe I.2.4.1.2.1.). L’utilisation de mélanges peptidiques, avec des temps d’élution distribués sur l’ensemble du chromatogramme, peut permettre d’améliorer la prédiction des temps de rétention, et ainsi de corriger les fenêtres de scan des autres peptides en temps réel (Gallien et al., 2012b).
La sensibilité des analyses doit être améliorée, notamment en diminuant la gamme dynamique de l’échantillon ou le bruit de fond de l’analyse. La SRM est une technique capable de mesurer la concentration de protéines sur 4 à 5 ordres de magnitude (Picotti et al., 2009) (Kuzyk et al., 2009). Le sérum par exemple présente une gamme dynamique de 12 ordres de magnitude. Les techniques de préfractionnement les plus communes permettent un gain de sensibilité d’environ 3 ordres de magnitude. Les protéines les plus minoritaires sont donc encore difficiles à détecter ou quantifier. Les améliorations des techniques de préfractionnement sont une possibilité, au risque d’introduire des biais dans la quantification, d’engendrer des pertes d’échantillon, et de limiter les analyses à haut débit. Certaines innovations instrumentales permettent d’améliorer la sélectivité, notamment la MRM cube (MRM3) sur des instruments de type QTRAP. Dans cette technique, une étape supplémentaire de fragmentation et de sélection des ions fragments est réalisée dans une trappe linéaire, située au niveau du Q3 de l’instrument (Figure 11). Cela permet d’améliorer la spécificité, et donc d’abaisser le bruit de fond. Ainsi le ratio signal / bruit est augmenté, permettant de diminuer la limite basse de quantification (LLOQ) (Fortin et al., 2009). Néanmoins, cette approche augmente le temps de cycle de l’instrument, et diminue donc la capacité d’analyse à haut débit.
Malgré le gain de sélectivité conféré par les deux étapes de filtre en SRM (au niveau du précurseur et de l’ion fragment), la résolution unitaire du quadripôle ne permet pas une élimination systématique des interférences (Sherman et al., 2009a), qui peuvent alors altérer la précision et l’exactitude de mesure. Pour pallier ces limitations, plusieurs solutions existent. Une validation manuelle des transitions peut être effectuée, mais cette solution est chronophage et comporte un risque de validation subjective en fonction de l’utilisateur. Des solutions informatiques sont disponibles pour automatiser cette étape. Par exemple, un algorithme nommé AuDIT a été développé pour automatiser la détection des transitions polluées par des interférences dans les expériences de quantification (Abbatiello et al., 2010). Ceci
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permet d’augmenter la précision et l’exactitude de mesure. D’autres solutions permettent de prédire les transitions sur la base de leur unicité de séquence. Pour cela les interférences des transitions des peptides d’intérêt sont simulées en utilisant une base de données. Celle-ci est composée de l’ensemble des transitions théoriques résultant de la digestion trypsique in silico du protéome ciblé (Sherman et al., 2009b). Cette approche présente certaines limites, puisque les modifications post-traductionnelles ainsi que les éventuels peptides non clivés, sont difficiles à prendre en compte.
En résumé, bien qu’elle soit la méthode de référence dans les expériences de quantification absolue des protéines, la SRM souffre de certaines limitations de sensibilité, de multiplexage et de spécificité. Des réponses sont apportées grâce au développement d’outils informatiques, et aux développements instrumentaux. Typiquement, la MRM cube a permis de surpasser certaines limites de spécificité, au prix d’un degré de multiplexage inférieur. Récemment, les appareils à haute résolution HR/HM (High Resolution / Accurate Mass) sont apparus comme des alternatives prometteuses. Ces analyses sont réalisées classiquement sur des appareils nouvelle génération, composés d’un analyseur Orbitrap (Olsen et al., 2009), permettant de distinguer les composés d’intérêts des interférences. La spécificité d’analyse est donc augmentée, et donc potentiellement la sensibilité. La gamme dynamique mesurable est quant à elle inférieure à celle d’une trappe linéaire. Dans une étude menée sur un instrument à analyseur Orbitrap (Exactive), Kaufman et al. ont montré, que des pertes de signal d’un analyte d’intérêt peuvent se produire, lorsqu’ils sont co-élués avec d’autres ions multichargés. Les analyses en matrices complexes peuvent donc induire des pertes complètes d’un analyte d’intérêt sur des analyseurs à haute résolution. (Kaufmann et al., 2010). Le nouvel instrument Q- Exactive, qui combine un quadripôle et un analyseur Orbitrap, représente une alternative intéressante. Cet instrument permet de faire une première étape de sélection, puis une mesure de masse HR/AM, c'est-à-dire une première étape de décomplexification de l’échantillon pour améliorer la gamme dynamique, suivi d’une analyse à haute résolution (Gallien et al., 2012a).
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I.2.4.2. L’analyse ciblée sur un instrument quadripôle-Orbitrap
L’instrument Q-exactive est constitué de quatre éléments principaux. Le quadripôle, qui permet de sélectionner un précurseur de m/z désiré, la C-trap qui permet d’accumuler les ions, la cellule HCD (High-energy Collision Dissociation), et l’analyseur à haute résolution Orbitrap (Figure 14). Cette configuration permet de réaliser des analyses ciblées, grâce à la sélection d’un peptide précurseur dans le quadripôle. Contrairement à la SRM, une seconde étape de filtre n’est pas physiquement possible. Cette seconde étape de sélection est apportée par la haute résolution que confère l’analyseur Orbitrap.
Figure 14 : Représentation schématique de l’instrument Q-Exactive (Thermo).
L’instrument est constitué de quatre éléments principaux. (1) un quadripôle, (2) une C-trap, (3) une cellule HCD, (4) un analyseur Orbitrap.
En comparaison aux précédents instruments couplant des trappes linéaires à un analyseur Orbitrap, le couplage avec un quadripôle permet d’améliorer la vitesse de transfert des ions. De plus, le Q-Exactive a une vitesse d’analyse augmentée, grâce à l’amélioration de la rapidité de la cellule HCD (Michalski et al., 2011).
Quadripôle C-trap Orbitrap Cellule HCD 1 2 4 3 1 4 3 2 Quadripôle C-trap Orbitrap Cellule HCD 1 1 2 2 4 4 3 3 1 1 4 4 3 3 2 2
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I.2.4.2.1. Les modes d’analyses ciblées sur un instrument quadripôle-