4. Résultats
4.1. Rôles des récepteurs de chimiokines comme marqueurs de cellules T CD4 + à fonctionnalité
4.1.2. Les récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 identifient des cellules T CD4 + avec susceptibilité
La susceptibilité des quatre sous-populations de cellules T CD4+ Th1 (CXCR3+CCR6-), Th2 (CCR4+CCR6-), Th1Th17 (CXCR3+CCR6+) et Th17 (CCR4+CCR6+) à la réplication des souches R5 ou X4 du VIH-1 a été déterminée in vitro. La mesure de la réplication virale a été réalisée par quantification de la production de la p24 dans les surnageants de culture par ELISA. La quantification de la charge ADN de VIH total et proviral (intégré) a été réalisée par PCR en temps réel en utilisant des amorces et des sondes FRET spécifiques. La réplication de la souche R5 a été détectée à des niveaux élevés dans les cellules T CCR4+CCR6+ et CXCR3+CCR6+, mais à des niveaux faibles, voire indétectables dans les cellules CCR4+CCR6- et CXCR3+CCR6-, sur une période de 12 jours post-infection (Figure 7A). À jour 3 post- infection, les niveaux de l’ADN viral intégré et total étaient relativement élevés dans les
CXCR3+CCR6- (Figure 7B). La réplication de la souche X4 a été détectée, également, à des hauts niveaux dans les sous-populations CCR4+CCR6+, CCR4+CCR6- et CXCR3+CCR6+ et à des niveaux faibles, voire indétectables, dans les cellules T CXCR3+CCR6- (Figure 7C). Les niveaux de l’ADN intégré et total de la souche X4 étaient plus élevés dans les cellules T CCR4+CCR6+ et CXCR3+CCR6+ comparées aux cellules T CXCR3+CCR6-, à jour 3 post- infection (Figure 7D). En corrélation avec leur niveau d’expression de CXCR4 (résultats non présentés) (55), les cellules T CCR4+CCR6- étaient permissives à l’infection de la souche X4 du VIH (Figure 7C-D). Curieusement, les cellules T CXCR3+CCR6- ont été relativement résistantes à la réplication des deux souches X4 et R5 et les niveaux de l’ADN intégré des deux souches virales étaient significativement plus faibles comparées aux cellules T CXCR3+CCR6+, à jour 3 et 12 post-infection (Figure 7A-D) (valeurs p du test t de Student apparié <0.05 ; cellules T CXCR3+CCR6+ versus CXCR3+CCR6-). Cette différence a été remarquée malgré l’expression modérée ex vivo de CCR5 et CXCR4 à la surface des cellules CXCR3+CCR6- (résultats non présentés) (55). De plus, d’autres études dans notre laboratoire utilisant différents clones du VIH (e.g. souche YU2 de tropisme R5 ou souche NDK de tropisme X4) ont confirmé la réplication préférentielle du VIH-1 dans les quatre sous- populations cellulaires (résultats non présentés) (55). La réplication de la souche virale de type R5 dans les cellules T CCR4+CCR6+ et CXCR3+CCR6+ a été beaucoup plus importante comparativement à la réplication de la souche virale de type X4. En somme, nos résultats démontrent que (i) les cellules T CCR4+CCR6+ et CXCR3+CCR6+ sont hautement permissives à la réplication des souches R5 et X4 du VIH-1 ; (ii) les cellules CCR4+CCR6- sont permissives aux souches X4 du VIH-1 seulement, et (iii) la sous-population T CXCR3+CCR6- est relativement résistante à la réplication des souches R5 et X4 du VIH-1 in vitro. Pour déterminer un lien potentiel entre la réplication du VIH et la prolifération des cellules, les quatre sous-populations cellulaires ont été chargées en CFSE, stimulées en présence des Ac anti-CD3 et anti-CD28 pendant 5 jours, et le pourcentage de prolifération a été déterminé à l’aide de la cytométrie en flux. Les résultats démontrent des niveaux maximaux de prolifération cellulaires pour les quatre sous-populations cellulaires testées (Figure 8), signifiant que la susceptibilité différentielle à l’infection par le VIH-1 des quatre sous- populations de cellules T n’est pas due à des différences dans leur capacité de prolifération après stimulation via le RTC. Ainsi, les mécanismes moléculaires à la base de ces propriétés
fonctionnelles distinctes restent à être identifier. Considérant le rôle essentiel des souches R5 durant la transmission du VIH-1, les cellules T CD4+ CCR4+CCR6+ et CXCR3+CCR6+ pouraient contribuer significativement à la pathogénèse du VIH-1 in vivo.
Note: Ces résultats ont été générés en collaboration avec les autres membres du laboratoire du
Dr Ancuta, notamment Annie Gosselin et Dr Patricia Monteiro, et ont été inclus dans un article publié dans The Journal of Immunology, 2010, dont je suis co-auteure (55). Ma contribution à cet article consiste en la génération des résultats inclus dans la Figure supplémentaire 3 et de certains résultats inclus dans les Figures 1A, 1B, 1C, 2A, 2B, 2C, 3A et 3B.
Figures - Section 4.1
p=0.015 p=0.015 p=0.0001 p=0.0001 NS p=0.01 C A CXCR3 CCR4 CCR4+CXCR3- CCR4-CXCR3+ B CD4 CCR6 CD4 CCR6 R4+R6+ R4+R6- X3+R6+ X3+R6-IL-17 IL-5 IFN-γ
p=0.015 p=0.015 p=0.0001 p=0.0001 NS p=0.01 C A CXCR3 CCR4 CCR4+CXCR3- CCR4-CXCR3+ B CD4 CCR6 CD4 CCR6 R4+R6+ R4+R6- X3+R6+ X3+R6-
IL-17 IL-5 IFN-γ
Cellules T CD4+
48%
46%
45% 54%
Figure 6: Les récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 er CCR6 identifient des sous- populations des lymphocytes T CD4+ ayant un profil de polarisation de type Th1, Th2, Th1Th17 ou Th17. Les PBMCs des sujets non-infectés par le VIH ont été marquées à la
surface avec des Ac anti-CD3, -CD4, -CD45RA, CCR4, CXCR3 et CCR6 couplés à des fluorochromes et ont été analysées par cytométrie en flux. (A) L’expression de CCR4 et de CXCR3 identifie quatre sous-populations de cellules T CD4+ mémoires, incluant les sous- populations CCR4+CXCR3- et CCR4-CXCR3+. (B) L’expression de CCR6 identifie quatre autres sous-populations cellulaires au sein des populations CCR4+CXCR3- et CCR4-CXCR3+ : CCR4+CCR6+, CCR4+CCR6-, CXCR3+CCR6+ et CXCR3+CCR6- . Les résultats en A et B sont représentatifs des résultats obtenus sur >10 donneurs différents. (C-D) Les lymphocytes T CD4+ totaux ont été d’abord purifiés à l’aide des billes magnétiques en utilisant un kit Miltenyi de sélection négative (MACS). Ensuite, les quatre sous-populations cellulaires identifiées du panel B ont été isolées par cytométrie en flux et ont été stimulées avec des Ac anti-CD3 immobilisés (1µg/ml) et anti-CD28 soluble (1µg/ml) pendant 3 jours. (C) La mesure de la production des cytokines IL-17, IL-5 et IFN-γ a été quantifiée par ÉLISA. Les résultats sont représentatifs des expériences réalisées sur des cellules de n=7 (IL-17), n=14 (IL-5), et n=9 (IFN-γ) sujets différents. Les valeurs p du test de Wilcoxon sont indiquées dans les figures. Les lignes horizontales indiquent les valeurs médianes. NS : non significatif. Voir la page suivante.
D
D
D
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Figure 6 (suite): Les récepteurs de chimiokines CCR4, CXCR3 et CCR6 identifient des sous-populations des lymphocytes T CD4+ à profil de polarisation Th1, Th2, Th1Th17 et Th17. (D) La mesure de l’expression des facteurs de transcription associés aux sous-
populations Th1, Th2, Th17 et les cellules T régulatrices a été quantifiée par RT-PCR en temps réel. Ces résultats sont représentatifs des expériences réalisées sur des cellules de n=4 (pour les cellules Th1, Th2, Th1Th17 et Th17) et de n=2 donneurs différents (pour les populations T CD4+ CD25+ et CD25-) (moyenne ± déviation standard provenant des duplicata). *, p<0.05, test de Student, échantillons non appariés (Note: l’expression de l’ARNm de RORC et de T-bet dans les cellules T R4+R6+ et X3+R6+ a été comparée à celle des autres types cellulaires ; l’expression de l’ARNm de GATA3 dans les cellules T R4+R6- a été comparée à celle des autres types cellulaires ; et l’expression de l’ARNm de FoxP3 dans les cellules T CD25high a été comparée à celle des autres types cellulaires).
Figure 7 : Analyse de la susceptibilité à la réplication des souches R5 et X4 du VIH des lymphocytes T CD4+ CCR4+CCR6+, CCR4+CCR6–, CXCR3+CCR6+, et CXCR3+CCR6.
Les quatre sous-populations cellulaires ont été triées par MACS et par FACS comme décrit dans Figures 6A et 6B. Les cellules ont été, ensuite, stimulées avec des Ac anti-CD3 immobilisés (1 µg/ml) et anti-CD28 solubles (1 µg/ml) pendant 3 jours, puis exposées à des souches R5 (NL4.3BaL) ou X4 (NL4.3) du VIH (50 ng p24 de VIH/106 cellules) pendant 3 heures à 37°C. L’excès de virus non-liés aux cellules a été éliminé par lavage et les cellules ont été cultivées à 106 cellules par ml dans le milieu RPMI 1640 10% FBS, en présence de l’IL-2 (5 ng/ml). (A, C) Les surnageants ont été recueillis tous les trois jours post-infection et les niveaux de p24 de VIH ont été mesurés par ELISA. (B et D) La charge virale ADN du VIH intégré et total a été quantifiée par PCR en temps réel à jours 3 et 12 post-infection. Les figures A à D illustrent les résultats d’une expérience représentative des résultats obtenus avec des cellules provenant de plus de trois sujets (moyenne ± déviation standard des duplicatas (A et C) ou quadruplicatas (B et D)). Les valeurs p du test de Student, échantillons non appariés, sont indiquées dans les figures B et D. (Note: le nombre de copies d’ADN proviral ou d’ADN viral total a été comparé dans les cellules T R4+R6+ versus R4+R6- et dans les cellules T X3+R6+ versus X3+R6-). A B C D p<0.0001 p=0.003 p=0.005 p=0.05 p=0.0001 p=0.006 A B C D p<0.0001 p=0.003 p=0.005 p=0.05 p=0.0001 p=0.006
CSFE N o m b re d e cellu les CXCR3+CCR6+ CXCR3+CCR6- CCR4+CCR6+ CCR4+CCR6- Donneur #1 Donneur #2
Figure 8: Prolifération polyclonale des cellules T CD4+ CCR4+CCR6+, CCR4+CCR6-, CXCR3+CCR6+ et CXCR3+CCR6-. Les sous-populations de cellules T
CD4+ triées par MACS et ensuite par FACS ont été chargées en CFSE (0.5 µM) et stimulées via CD3/CD28 pendant 5 jours. La prolifération cellulaire est associée à la dilution de la CFSE. Le pourcentage de cellules CFSElow est indiqué dans la figure pour chaque sous-population. Les résultats présentés dans cette figure sont représentatifs de deux expériences effectuées avec des cellules provenant de deux donneurs différents.
4.2. Analyse phénotypique et fonctionnelle des cellules T spécifiques au VIH