Le récepteur DOR transmet l'information conformationnelle à son effecteur Kir

Nos données BRET et co-ip présentées dans les sections précédentes indiquent que le récepteur DOR, la sous-unité GαoA, le dimère Gβ1γ2 ainsi que le canal Kir3.1/Kir3.2 interagissent ensemble à l'état basal et que ces interactions restent maintenus même suite à la stimulation du récepteur avec des agonistes DOR. Cependant, les modifications qui affectent les interactions entre les différents partenaires signalétiques et comment la transmission de l'information conformationnelle navigue du récepteur vers l'effecteur, au cours de la transduction du signal, restent encore mal connues. Dans ce qui suit, on présentera les différentes étapes qui nous ont menés à répondre à ces questions.

Dans une première série d'expériences, on a débuté par évaluer la plus simple voie de transmission d'information entre deux protéines, étant la voie directe DOR-Kir3. Ayant déjà obtenu une courbe saturable en BRET, à l'état basal, pour l'interaction entre le récepteur DOR et le canal Kir3 comme indiqué précédemment, on a voulu identifier si une stimulation aigue avec différents ligands, connus pour avoir différentes efficacités à activer le récepteur DOR, était capable de modifier le signal BRET basal observé. Ces derniers incluent des ligands classifiés comme étant des agonistes complets (SNC-80 et DPDPE), agonistes partiels (morphine, UFP512 et TIPP), agonistes inverses (TICP) et finalement des antagonistes (naloxone et naltrindole) pour le récepteur DOR [40, 51, 335]. Nos résultats ont montré qu'aucun ligand n'était capable de modifier significativement le signal BRET basal. Cela montre qu'aucune information conformationnelle n'est transférée à l'effecteur via l'interface DOR/Kir.

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Puisque la voie directe n'a montré aucun transfert conformationnel, on a essayé de chercher des voies alternatives. Alors, on s'est demandé s'il était possible que le récepteur DOR serait capable d'utiliser les sous-unités de la protéine G comme unités intermédiaires pour transférer son signal à l'effecteur Kir3. On a commencé à répondre à cette question en établissant si les mêmes ligands DOR qui étaient sans effet à l'interface DOR/Kir pourraient modifier le transfert d'énergie entre le récepteur DOR et le dimère Gβγ et entre cette dernière et le canal Kir3. Pour ce faire, des courbes doses réponses BRET caractérisant les interfaces DOR/Gβγ et Gβγ/Kir3 ont été réalisées. D'une manière intéressante, les changements BRET pour chacune des deux interactions ont été positivement corrélés. Ceci indique que l'information conformationnelle transmise du récepteur DOR au dimère Gβγ a été suivie par une transmission identique du dimère Gβγ aux sous-unités du canal Kir3.1/Kir3.2. Ensemble, ces données indiquent l'implication de la protéine G dans la transmission de l'information conformationnelle du récepteur DOR au canal Kir3.

Bien que nous ayons regardé les changements BRET au sein de notre complexe préformé suite à des stimulations avec différents agonistes DOR, on s'est intéressé à caractériser l'effet de ces stimulations sur l'activité du canal Kir3. Nos données ont permis de montrer que les ligands qui affichaient la plus forte puissance et efficacité à modifier le signal BRET à l'interface Gβγ/Kir3 ont également été capables d'augmenter la perméabilité des canaux Kir3 suite à l'activation des récepteurs DOR.

Finalement, on a voulu identifier si la transmission de l'information conformationnelle, suite à l'activation du récepteur DOR, entre le dimère Gβγ et le canal Kir3 se réalisait par voie directe. Pour ce faire, on a généré un canal Kir3 dont les brins βD-βE et βL-βM, au niveau du domaine C-terminal, ont été supprimés. Ces brins sont reconnus pour être un site de liaison du dimère Gβγ [382] et pour leur rôle critique dans l'activation du canal Kir3 à travers ce même dimère [383, 384]. On a ainsi prédit que si le réarrangement conformationnel était transmis du dimère Gβγ au canal Kir3 par voie directe, alors l'élimination du site de liaison entre ces deux partenaires devrait interférer avec les réarrangements structuraux observés à l'interface Gβγ/Kir3. En utilisant la technique de BRET, nos données ont montré une abolition de l’effet des ligands ayant préalablement eu un impact sur la conformation Gβγ/Kir3. Donc, pour résumer la première partie de notre étude de conformation, on pourrait dire que nos résultats

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montrent et supportent le fait que l'information conformationnelle est transmise du récepteur DOR au canal Kir via le dimère Gβγ.

Tous les résultats présentés dans cette première partie de l'étude conformationnelle étaient concentrés sur le rôle que joue le dimère Gβγ dans la transmission de l'information conformationnelle. Mais, quel rôle joue alors la sous-unité Gα dans cette même transmission ? Malgré que certains données indiquent la présence d'une interaction directe entre le GPCR et le dimère Gβγ [385], d'autres, basées sur des études de cristallisation, ont signalé l'absence d'une interaction directe au niveau de cette même interface [7, 316]. De plus, des études antérieures, réalisées en absence de toute expression du canal Kir3, indiquent que la sous-unité Gα interagit avec le récepteur et les sous-unités Gβγ [212, 230] et qu'elle intervient dans la transmission du signal conformationnel du récepteur DOR au dimère Gβγ [230]. Ensemble, ces données visent vers le rôle important que pourrait jouer la sous-unité Gα dans la navigation de l'information conformationnelle émise par un RCPG. Alors, on s'est intéressé à identifier le rôle de la sous-unité Gα dans la transmission conformationnelle du signal au canal Kir3. Nos données montrent que les changements BRET observés aux interfaces Gα/Gβγ et Gβγ/Kir3 suivaient la même cinétique permettant ainsi de vérifier, en partie, les études antérieures et indiquant la possible implication de Gα dans la navigation de l'information au canal Kir3 via le dimère Gβγ.

Dans une dernière série d'expériences, on s'est intéressé à savoir si Gα était capable de transmettre l'information conformationnelle au canal Kir par voie directe. Des études parues récemment ont rapportées le fait que Gα inactif ne montre aucune interaction directe avec les sous-unités Kir3.1/Kir3.2 [324, 344] et ont proposé que cette sous-unité s'associe avec les canaux Kir3 via le dimère Gβγ [324]. Pourtant, certaines données de résonance magnétique nucléaire ont révélé la présence d'une interaction directe entre Gαi3-GTP et l'hélice αA de la sous-unité Kir3.1 [326], ce qui suggère que Gα et le canal peuvent entrer en contact direct suite à l'activation de la protéine G. On est allé alors vérifier en BRET la présence d'une interaction entre la sous-unité GαoA et la sous-unité Kir3.1 du canal suite à l'activation du récepteur avec un agoniste DOR. Nos données montrent qu'aucun signal BRET n'a pu être détecté à l'interface GαoA/Kir3.1 à l'état basal ni suite à l'activation du récepteur DOR par un de ses agonistes complets, le SNC-80. Cependant, depuis qu'il a été démontré que l'étiquetage de la sous-unité Gα pourrait interférer avec l'activation de l'effecteur Kir3 [324], nous ne

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pouvons pas exclure le fait qu'un défaut dans la transduction du signal vers le canal Kir3 pourrait empêcher la formation d'un changement de conformation entre GαoA et les sous-unités du canal.

Le problème d'étiquetage constitue une limitation majeure pour la technique de BRET. Cette dernière se définie par la grosseur des étiquettes utilisées pour marquer les paires de BRET à caractériser. Les étiquettes fréquemment utilisées sont la protéine fluorescente GFP et l’enzyme luciférase. Ayant chacune un poids moléculaire d’environ 35 kDa, semblable (37 kDa pour Gαo) ou parfois nettement supérieur (7 kDa pour Gγ) à certaines des protéines d'intérêt, les étiquettes BRET pourraient influencer, dans certains cas, l’interaction entre les différents composants du complexe. Très récemment, des solutions pour cette limitation commencent à apparaitre. Ces dernières consistaient à générer des étiquettes beaucoup moins volumineuses que celles fréquemment utilisées. Parmi ces étiquettes, on pourrait mentionné la NanoLuc, de 19 kDa, qui peut remplacer la luciférase [386] et le FlAsH (pour fluorescein arsenical hairpin binder), un petit dérivé de la fluorescéine, qui se lie à une étiquette de six acides aminés (CCPGCC) lui permettant d'émettre une fluorescence et qui pourrait être utilisé pour remplacer la protéine GFP [387].

Somme toute, nos données présentées dans l'étude conformationnelle de notre complexe préformé montrent que l'information conformationnelle est transmise du récepteur DOR au canal Kir via le dimère Gβγ. Durant cette transmission, l'interaction entre le récepteur DOR et le dimère Gβγ est estimée se réaliser par voie directe ou via la sous-unité Gα. Nos estimations pourraient cependant être vérifiées en identifiant tous les sites d'interaction entre le récepteur DOR et les sous-unités de la protéine Gαβγ. Ainsi, on pense que la cristallisation du récepteur DOR avec la protéine G hétérotrimérique serait le meilleur moyen pour que cette vérification soit envisageable. Finalement, la transmission de l'information conformationnelle de la sous-unité Gα au canal Kir3 serait aussi probable, cependant, l'impossibilité de surveiller cette interaction ne nous permet pas d'exclure que cette transmission pourrait avoir lieu.

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4.2 Étude de la régulation du complexe constitutif DOR/Kir3 suite