Pour réaliser l’invalidation constitutive du gène MTR dans le foie, nous avons réalisé des croisements entre la lignée porteuse de l’allèle MTR conditionnel (lignée MTR lox/lox) et la lignée Albumine-Cre

(lignée AC). La lignée AC permet la production de la Cre recombinase sous le contrôle du promoteur

de l’albumine, qui est actif dans le foie embryonnaire à partir d’environ E8.5 – E9.5 (Schuler et al.,

2004). Cette lignée permet donc la délétion du gène cible dans le foie à partir d’E8.5 – E9.5,

c’est-à-dire dès le début de l’organogenèse hépatique. Les effectifs des souris nées de ces croisements sont

indiqués dans le tableau 1. Aucune souris de génotype MTR homozygote muté n’a été retrouvée

dans ces portées. Les résultats montrent une létalité anténatale de l’invalidation hépatique

homozygote du gène MTR, en revanche à l’état hétérozygote l’invalidation n’a pas d’incidence sur la

viabilité. En l’absence de la population homozygote mutée, les pourcentages attendus des 3 autres

classes de génotypes montent à environ 33% (Tableau 1). La létalité prénatale de l’invalidation

homozygote confirme l’efficacité de la délétion du gène MTR dans notre modèle murin. Nous

montrons ici pour la première fois que l’invalidation homozygote de MTR dans le foie est létale in

utero. MTR est donc un gène essentiel au développement embryonnaire hépatique.

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*Conformément à la notation conventionnelle, les deux allèles du gène MTR sont notés « WT » pour l’allèle sauvage et « lox » pour l’allèle conditionnel comportant les sites LoxP

2. Analyse des embryons MTR-/- à différents stades

Nous avons ensuite cherché à déterminer à quel stade embryonnaire se produit la mort in utero des

embryons MTR-/-, et par quel mécanisme. Pour cela, nous avons analysé des portées d’embryons à

différents stades de développement après la mise en place de la délétion du gène MTR. Partant du

principe qu’un délai d’au moins 48h après activation du promoteur de l’albumine (vers E8.5 – E9.5)

est sans doute nécessaire pour que la Cre soit produite, transportée dans le noyau, pour qu’elle

recombine l’ADN et que les cellules soient déplétées en protéine MTR, nous avons analysé des

embryons au stade E11.5 ainsi qu’aux stades ultérieurs.

Par croisements des lignées AC et ML, nous avons obtenu des souris AC ; MTRWT/lox en génération

F1. Les mâles AC ;MTRWT/lox ont été croisés avec des femelles MTRlox/lox et les bouchons vaginaux

ont été relevés chaque matin pour déterminer le jour de fécondation. Les portées d’embryons ont

été disséquées à différents stades embryonnaires entre E11.5 et E17.5. Chaque embryon a été

génotypé par PCR sur de l’ADN extrait de queue et nous avons compté les embryons AC ;MTRlox/lox

(notés MTR-/-). Les résultats sont présentés dans le tableau 2.

Croisement : mâles MTRlox/WT ; Alb-Cre X femelles MTRlox/lox ; WT

Génotype Notation % attendu % constaté

MTRlox/WT ; WT WT* 25 % 35 %

MTRlox/lox ; WT WT 25 % 32 %

MTRlox/WT ; Alb-Cre +/- ou hétérozygote 25 % 33 % MTRlox/lox ; Alb-Cre -/- ou homozygote 25 % 0 %

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Stade embryonnaire ^{Nombre total} d'embryons testés Nombre d'embryons MTR^-/- (pourcentage) Pourcentage attendu d’embryons MTR^-/- E11.5 9 0 (0,0 %) (25%) E12.5 40 1 (2,5 %) (25%) E13.5 9 3 (33,3 %) (25%) E14.5 28 1 (3,6 %) (25%) E15.5 28 2 (7,1 %) (25%) E17.5 15 0 (0,0 %) (25%)

Ces données sont à compléter car les effectifs d’embryons testés sont insuffisants aux stades E11.5,

E13.5 et E17.5. Néanmoins nous constatons un pourcentage d’embryons MTR-/- significativement

inférieur au pourcentage attendu, indiquant un effet délétère très sévère de la délétion hépatique de

MTR. L’effet délétère est très précoce puisque dès E11.5, le pourcentage d’embryons MTR-/-

obtenus chute. Des embryons MTR-/- sont présents aux stades ultérieurs à E11.5. A tous les stades

étudiés, les embryons de génotype MTR-/- avaient une taille et une morphologie normales, et leur

foie également. La détection de la protéine MTR par marquage immunofluorescent sur coupes

d’embryons aux stades embryonnaires E13.5 et E15.5 a montré l’absence de diminution de cette

protéine chez les individus hétérozygotes ou homozygotes mutés par rapport aux contrôles (Figure

15). La spécificité de l’anticorps anti-MTR a été évaluée par des immunomarquages sur des cellules

HepG2 en culture transfectées avec un siRNA-contrôle ou avec un siRNA-MTR (figure 15B). La

diminution de la quantité de protéine MTR avec le siRNA-MTR est visible, ce qui atteste de la

spécificité de l’anticorps. Nous avons cherché à nous assurer que les embryons qualifiés de mutants à

l’issue du génotypage étaient bien de génotype MTR-/-. Les embryons sont génotypés par PCR sur de

l’ADN extrait de l’extrémité de la queue, prélevée au moment de la dissection. Nos génotypages

auraient pu être faussés par une contamination avec de l’ADN maternel au moment du prélèvement

des embryons, aussi nous avons confirmé chaque génotypage en extrayant de l’ADN à partir des

coupes d’embryons. Les résultats ont confirmé ceux obtenus sur queue d’embryon.

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Notre hypothèse est que la délétion de MTR n’est pas synchrone chez tous les embryons, il y a une

variabilité du stade embryonnaire auquel elle se met en place, entre E11.5 et E15.5. Dès que la

délétion est effective, les effets délétères sur le foie mènent très rapidement à la mort de l’embryon

car le foie est en effet un organe essentiel à sa survie.

Dans le but d’étudier les conséquences délétères de la délétion de MTR chez ces embryons,