Immobilisation par encapsulation I.3.3.5
I.4. Réactions en cascade enzymatique
I.4.1. Généralités
Le développement de nouveaux processus chimiques efficaces est devenu un des buts majeurs de la recherche en chimie organique. Les chercheurs ont pris conscience que même si la synthèse organique progresse très rapidement, ce domaine nécessite encore des améliorations de type écologique191,192. Le remplacement des processus stœchiométriques en processus catalytiques, l‘utilisation d‘enzymes isolées ou de microorganismes entiers en synthèse organique et la combinaison de plusieurs réactions en une étape dite one-pot sans isolement des intermédiaires sont considérés comme des stratégies majeures pour développer des procédés plus respectueux de l‘environnement13. En effet, les processus de ce type réduisent les temps de réaction et les déchets permettant ainsi d‘éviter l‘accumulation d‘intermédiaires instables ou toxiques et les purifications. Ceci conduit à des procédés plus sécurisés où les réactions secondaires sont évitées et de meilleurs rendements sont obtenus. Plusieurs expressions sont utilisées pour qualifier l‘enchainement de réactions, réactions domino, réactions en cascade ou encore réactions tandem. En ce qui concerne ce manuscrit nous adopterons le terme cascade, plus communément rencontré dans le domaine de la biocatalyse pour qualifier un procédé one-pot.193
Une grande variété de réactions enzymatiques s‘effectue dans les organismes vivants et plus particulièrement dans le cytosol. Reproduire ces enchainements naturels est un secteur de recherche en plein essor, grâce aux outils de la biologie moléculaire facilitant l‘accès aux enzymes.193 Par conséquent, de nombreuses recherches ont été menées pour copier ou mimer ces cascades enzymatiques in vitro, parfois même en associant la notion de compartiment grâce à l‘immobilisation des enzymes. Des systèmes multienzymatiques d‘une complexité remarquable ont été alors développés. Ces dernières années on voit aussi apparaître des travaux sur la construction de cascades dans une cellule hôte en sur-exprimant deux ou trois enzymes cibles, la cascade est alors produite « in cellulo »194. Nous ne présenterons pas ce type de résultats dans cette partie bibliographique.
Certaines réactions comme les réactions d‘oxydo-réduction, de transfert d‘un groupement amino ou phosphate nécessitent la présence d‘un cofacteur. Cependant, lorsque le cofacteur a un coût élevé ou et qu‘il provoque des phénomènes d‘inhibition, la mise en place d‘un système de régénération permettant de maintenir le cofacteur à une concentration catalytique est absolument indispensable. La conséquence directe est alors l‘association d‘une ou plusieurs enzymes dédiées à cette régénération. De tels systèmes de régénération ont été développés pour l‘adénosine triphosphate (ATP)195 et les nicotinamides (NAD(P) + / NAD(P)H)196.
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(i) Les cascades linéaires dans lesquels un substrat unique est converti en un produit en passant par un ou plusieurs intermédiaires selon une réaction one-pot (Schéma I.20-A). De plus, elles facilitent le déplacement des réactions réversibles dans un sens unique, puisque le produit de la réaction sera consommé par la réaction suivante qui doit être irréversible. (ii) Les cascades orthogonales (Schéma I.20-B) dans lesquelles les transformations du substrat
en produit sont couplées avec d‘autres réactions dans le but de régénérer les cofacteurs ou les cosubstrats ou bien encore d‘éliminer les produits secondaires.
(iii) Les cascades parallèles dans lesquelles deux substrats sont convertis en deux produits par deux réactions biocatalytiques différentes mais couplées grâce à l‘utilisation de cofacteurs ou de cosubstrats communs (Schéma I.20-C). Dans ce type de cascade, les deux produits sont d‘intérêt et sont isolés, ce qui n‘est pas le cas pour les cascades orthogonales où les sous-produits sont éliminés.
(iv) Les cascades cycliques dans lesquelles un substrat est sélectivement converti en un intermédiaire qui est ensuite transformé à nouveau en produit de départ (Schéma I.20-D). Ce concept a été fréquemment utilisé pour effectuer la déracémisation197 d‘acides aminés, d‘acides alpha-hydroxylés et d‘amines.
A/ S I P B/ C/ D/ S P X Y Z S1 P1 P2 S2 S1 S2 I S2
Schéma I.20 : Différentes conceptions des cascades enzymatiques : A/ cascade linéaire, B/ cascade orthogonale, C/ cascade parallèle, D/ cascade cyclique13
La classification présentée ci-dessus n‘est pas stricte puisque la conception de la cascade est souvent une combinaison de ces différents types. Par exemple, une étape d‘une cascade linéaire pourrait nécessiter une réaction orthogonale supplémentaire pour régénérer un cofacteur. De même, la dégradation d'un sous-produit de réaction dans une cascade orthogonale peut impliquer plus d'une étape et donc constituer une séquence en cascade linéaire qui lui est propre13.
Les synthèses enzymatiques one-pot peuvent être effectuées en ajoutant toutes les enzymes en une seule fois, soit simultanément ou séquentiellement dans le récipient. Les avantages d‘une synthèse
one-pot sont les suivants13 : (i) déplacement de l‘équilibre d‘une réaction réversible, (ii) simplification de la purification et meilleurs rendements, (iii) augmentation de la vitesse de la réaction, (iv) disparition des effets d‘inhibition, (v) élimination des problèmes de solubilité. Surtout dans le cas de
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composés stéréo-isomères, une conversion et une sélectivité > 99% sont souhaitées dans l'industrie parce que la séparation des produits peut être très coûteuse198. Le déplacement de l‘équilibre dans une réaction one-pot, sans introduire d'autres opérations, est un moyen efficace pour atteindre cet objectif199,200. Lorsqu‘une ou plusieurs réactions réversibles sont en série avec une réaction irréversible, les rendements et la sélectivité sont améliorés201. Cela signifie également une réduction des coûts opérationnels et des coûts en matières premières en raison de la conversion complète des substrats en produits souhaités. Lorsque le substrat ou le produit est inhibiteur, les réactions sont caractérisées par des vitesses lentes et des conversions faibles202. Dans ce cas, les réacteurs one-pot présentent un réel gain203. En effet, le composé responsable de l‘inhibition est formé puis retiré en continu du milieu réactionnel, il ne peut donc pas s‘accumuler. De plus, ce procédé est aussi particulièrement intéressant dans le cas de réactions qui impliquent des intermédiaires instables, à durée de vie très courte. À peine formé, ils sont directement transformés par la réaction suivante, des conversions élevées sont alors attendues.
Les réactions multienzymatiques one-pot présentent cependant quelques inconvénients13. Lorsque deux réactions sont exécutées séparément, les conditions optimales pour chacune peuvent être choisies. Par contre, lorsque plusieurs réactions sont exécutées dans le même réacteur, les conditions optimales pour chacune ne peuvent souvent pas être satisfaites. Un compromis doit être trouvé. De plus, il n‘est pas rare de rencontrer des problèmes d‘inhibition, le substrat d‘une enzyme pouvant se révéler inhibiteur de la deuxième.
Ces biotransformations peuvent être faites avec des enzymes qui sont soit libres en solution (catalyse homogène) soit immobilisées (catalyse hétérogène). L‘utilisation des enzymes co-immobilisées permet de conjuguer les bénéfices de l‘immobilisation et ceux des réactions en cascade simultanément. On se rapproche alors de systèmes naturels où plusieurs enzymes sont organisées dans des compartiments. Les termes « métabolisme artificiel » sont adjoints pour définir une cascade biomimétique, immobilisée ou non.
I.4.2. Cascades en phase homogène
De nombreuses réactions multienzymatiques effectuées en solution ont été rapportées. Il serait trop ambitieux de présenter ici cette littérature de façon exhaustive. Seuls quelques exemples ont été sélectionnés, en lien avec la production de DHAP et l‘utilisation d‘aldolases pour la synthèse de sucres et analogues. On en profitera pour mettre l‘accent sur des préparations de sucres phosphorylés, objets d‘étude de ce travail de thèse.
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