3.2 Optimisation du système papier pour la réalisation d’une réaction de LAMP
3.2.3 Réaction de LAMP sur papier
Afin de tester la réalisation d’une réaction d’amplification d’ADN LAMP dans un système papier em-bossé, le même mélange réactionnel que celui utilisé pour le test de biocompatibilité à été testé. En re-vanche, comme il n’est pas possible de suivre l’amplification en temps réel avec le Stratagene®, l’observa-tion de l’amplifical’observa-tion se fera en point final avec une analyse à l’aide d’un bioanalyser 2100 (Agilent, USA). Cette dernière repose sur la migration d’ADN sur un gel d’électrophorèse. Cela permet de séparer les brins d’ADN selon leur taille et ainsi de pouvoir déterminer s’il y a présence d’amplicons ou non. De part son fonctionnement (voir chp 1), la LAMP produit des amplicons de différentes tailles et les gels en résultant sont caractérisés par l’apparition de triplets de bandes tels que montré dans la figure 3.14.
calcu-3.2. OPTIMISATION DU SYSTÈME PAPIER POUR LA RÉALISATION D’UNE RÉACTION DE LAMP
FIGURE3.14 – Analyse de témoins positif et négatif sur gel d’électrophorèse.
lant l’aire du pic associé qui est retranscrit en concentration d’ADN par le logiciel lié au bio-analyseur. Cette transcription se fait grâce à une calibration effectuée sur chacun des gels avec des marqueurs de concen-trations connues fournis avec le kit du bio-analyseur (bandes marquées en vert et violet sur les images des gels).
Cette analyse en point final nécessite donc de pouvoir prélever du liquide dans le système. Afin de per-mettre cela, le protocole de fermeture du système papier a été modifié. Un adhésif double face, découpé au niveau des réservoirs d’entrée et de sortie, est maintenant utilisé pour fermer le système (Figure 3.15). Afin de pouvoir pipeter facilement le liquide dans le système puis pour l’en extraire des connectiques ont été usinées dans une plaque de PMMA de 1mm d’épaisseur. Ces derniers consiste simplement en des car-rés de 2x2 cm2avec un trou traversant de 1 mm de diamètre permettant d’y insérer des cônes 100µL de micropipettes. Ces éléments sont ensuite collés à l’aide de l’adhésif double face au niveau des réservoirs. Finalement un adhésif MicroAmp® est apposé sur le reste du scotch double face pour assurer la bonne imperméabilité du système . Une fois le système rempli avec le mélange réactionnel, le système est totale-ment fermé en apposant du MicroAmp® au niveau des deux connectiques. Ainsi seul le retrait de ces deux derniers bouts de MicroAmp® sera ensuite nécessaire pour pouvoir accéder et extraire le liquide à la fin de l’étape de chauffage.
FIGURE3.15 – Fermeture d’un circuit embossé sur papier avec du scotch double face découpé.
Les résultats de ce test est présenté figure 3.16. Comme nous pouvons le voir sur cette analyse par élec-trophorèse, aucune amplification n’a eu lieu. Plusieurs hypothèses ont été évoquées pour expliquer cette inhibition totale. Afin de vérifier que cela n’est pas dû à une adsorption des molécules d’ADNs ou de l’en-zyme sur la couche polymère, un essai d’amplification a également été effectué dans un système ayant été préalablement passivé avec de la BSA (et ce, en plus de la présence de BSA dans le mélange réactionnel). Pour ce faire, une solution de BSA 1% a été introduite dans le système, a été laissée en incubation pen-dant 15 minutes, puis a été retirée avant l’introduction du mix. Comme présenté dans la figure 3.17, aucune
amplification n’a eu lieu dans ce dispositif.
FIGURE3.16 – Analyse sur gel d’électrophorèse d’une réaction de LAMP dans un dispositif Alu-SA.
FIGURE3.17 – Analyse sur gel d’électrophorèse d’une réaction de LAMP dans un dispositif Alu-SA coaté avec de la BSA.
Une autre hypothèse fut la biocompatilité de l’empilement Alu-SA. En effet lors des premiers tests de biocompatibilté seule la biocompatibilité de la couche de copolymère styrene accrylique, couche en contact direct avec le liquide, a été testée. Le test de biocompatibilité a ainsi été reproduit sur un papier possédant l’empilement Alu-SA. Ce test a de plus été effectué en déposant le mélange réactionnel sur la surface à testé, soit avant, soit après l’ajout de l’ADN. Les résultats de ces tests sont présentés en figure 3.18. La très faible différence de Ct entre ces tests et le témoin positif (< 1) vérifie que la double couche Alu-SA est compatible avec la LAMP selon ce protocole de test. Notons qu’une analyse de ces amplifications au bio-analyseur confirme également que l’amplification a été réalisée avec une amplitude similaire par rapport au témoin positif (figure 3.19).
3.3. CONCLUSION
FIGURE3.19 – Test de bio-compatibilté du revêtement Alu-SA : Gel d’electrophorèse.
Compte tenu de ces différents éléments de réponse, il semble que l’absence d’amplification provienne du relargage d’une substance inhibitrice à la LAMP lorsque le système est porté à 65°C. Des pistes pour remédier à ce problème sont actuellement en cours d’investigation. On peut par exemple citer les idées suivantes :
— Faire un recuit du papier pour essayer de relarguer les substances inhibitrice au préalable.
— Recouvrir par PVD la surface d’une fine couche de silice qui devra être assez compact pour éviter le relargage de la substance inhibitrice au sein du liquide.
— Changer l’adhésif double face.
— Tester avec une autre enzyme d’amplification isotherme. Cela pourrait être avec une autre enzyme de LAMP mais également avec une autre amplification isotherme telle que la RPA.
3.3 Conclusion
En conclusion, lors de ce chapitre, la thématique de la fabrication des systèmes microfluidiques a été évoquée. Nous avons vu comment le procédé de fabrication développé permet d’allier le bas-coût du ma-tériau papier aux avantages des écoulements capillaires spontanées. En particulier, dans les systèmes fa-briqués, l’écoulement se fait au sein de canaux microfluidiques et non dans une matrice fibreuse comme c’est classiquement le cas pour les systèmes microfluidiques papiers. Cela simplifie notamment l’étude des écoulements et rend le système plus robuste quant aux conditions environnementales. Cette méthode de fa-brication repose sur le thermoformage d’un papier couché. De façon à rendre la surface à la fois étanche (de façon à ce que le liquide ne s’imprègne pas dans la matrice papier) et hydrophile (de façon à ce qu’un écou-lement capillaire spontané puisse se produire) un revêtement double couche a été développé. Il consiste en un dépôt d’une première couche de Styrène Butadiène Rubber pour proférer la caractéristique d’étanchéité, puis d’une seconde couche d’alcool Poly-vinylique ou de copolymère de styrène d’acrylique pour rendre la surface hydrophile. Il s’est cependant avérer que cet empilement reste perméable à la vapeur d’eau, et qu’il ne permet donc pas le confinement du liquide lors de l’étape d’amplification d’ADN, se déroulant à 65°C. Pour remédier à ce problème la couche de SBR a été remplacée par un fin feuillet d’aluminium. Ce nouvel empilement permet alors de contenir le liquide dans le système lors du chauffage. Une autre difficulté est ensuite apparue : les dispositifs ainsi fabriqué provoque une inhibition de la réaction de LAMP. Et ce malgré les tests de bio-compatibilités effectués au préalables. La piste privilégiée pour expliquer cela est le relar-gage d’une substance inhibitrice à la LAMP par un des éléments lorsque celui-ci chauffé. Des pistes pour remédier à ce problème ont été évoquées et font, à l’heure actuelle, l’objet de tests.
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Chapitre 4
Développement des fonctions nécessaires au
diagnostic : le chauffage et la détection.
L’objet de ce chapitre est de présenter les développements effectués quant aux fonctions nécessaires pour la réalisation et la détection d’une réaction de LAMP. Pour cela, nous avons choisi de concentrer nos efforts sur des éléments réalisables par sérigraphie (voir Chapitre 1). En effet il s’agit d’un procédé indus-triel qui permet la réalisation de composants électroniques [1, 2, 3] sur des supports organiques souples et à faible coût. Le panel d’encres conductrices disponibles est ainsi assez large et va permettre la réalisa-tion des foncréalisa-tions souhaitées pour notre système. Un autre intérêt de cette technologie d’impression est la quantité relativement importante d’encre déposée, comparativement à d’autres techniques de dépôt telle que l’impression jet d’encre. En effet, l’épaisseur de la couche d’encre déposée (de l’ordre de 10 à 15µm) permet d’envisager une étape d’embossage du support sérigraphié qui minimise le risque de rupture des pistes conductrices imprimées. L’enchaînement de ces étapes pourrait ainsi permettre la création de sys-tèmes microfluidiques intégrés.
Dans ce chapitre les deux fonctions développées (le chauffage et la détection pHmétrique) seront étu-diées distinctement. Ce chapitre est ainsi dédié à la caractérisation et l’optimisation de ces fonctions pour une réaction de type LAMP. L’association de ces différentes fonctions ainsi que le couplage entre le procédé de sérigraphie et la technique d’embossage en vue de la création d’un système microfluidique intégré font l’objet du prochain et dernier chapitre de cette thèse.