2. GÉNÉRALITÉS
2.1. ASSURANCE QUALITÉ
2.1.4. Documentation du laboratoire
2.1.4.1. Rapports d’activités du service et publications.
C’est le relevé chronologique des analyses exprimées en unités B (lettre clé des analyses) effectuées par le laboratoire ou transmises par ce laboratoire à un autre laboratoire. Ce relevé doit être conservé pendant une période de dix ans
2.1.4.2. Résultats nominatifs des analyses.
Les résultats nominatifs des analyses (bulletin d’analyse) effectuées par le laboratoire doivent être conservés pendant une période d'au moins cinq ans.
2.1.4.3. Registres de laboratoire.
Les dossiers et livres de registre doivent être conservés pendant vingt ans.
2.1.4.4. Normes et procédures.
Il sera conservé un exemplaire des procédures et modes opératoires et de leurs modifications comportant la date de leur mise en œuvre, pendant la durée de leur utilisation et au moins trois ans après la fin de leur utilisation. [3]
2.1.4.5. Résultats des contrôles de qualité et corrections.
Les résultats des contrôles de qualité externes doivent être conservés pendant cinq ans. Le compte rendu des mesures prises pour corriger les anomalies observées à la suite du résultat du contrôle national de qualité, doit être conservé pendant cinq ans. Les résultats des contrôles de qualité internes sont à conserver trois années au moins.
Les documents relatifs aux instruments et à leur maintenance ainsi que ceux relatifs aux modifications des programmes informatiques sont à conserver pendant la durée d'utilisation de ce matériel et les trois ans suivants.
2.1.4.6. Documents relatifs aux appareils, aux réactifs, petits matériels et consommables.
Les documents relatifs aux appareils, réactifs, petits matériels et consommables sont à conserver pendant la durée de leur utilisation.
2.1.4.7. Dossiers administratifs.
Les actes administratifs concernant l’établissement qui abrite le laboratoire, ainsi que ceux du laboratoire lui-même, sont à conserver pendant toute la vie de l’établissement.
Les contrats relatifs à l'enlèvement des déchets sont à conserver pendant trois ans au moins ; et tous les autres contrats aussi longtemps que possible. [1]
2.2. INFECTION PAR LE VIRUS DE L’HEPATITE VIRALE B : 2.2.1. Historique
L’histoire des hépatites remonte à plus de 5 siècles avant J.C. Hippocrate, cinq siècles avant J.C. l’avait décrite en attribuant la responsabilité de ses manifestations cutanées et muqueuses au foie. Un siècle et demi après J.C, Galien distinguait les jaunisses liées à des obstructions biliaires et les jaunisses purement hépatiques. Le terme hépatite fut employé pour la première fois par Coelius Aurelianus, auteur médical romain du 5ème siècle après J.C.
Les premiers cas ont été rapportés en 1947 par Marc Callum et al pour distinguer l’hépatite épidémique à transmission essentiellement orale et l’hépatite parentérale. [4]
En 1963, l’antigène Australia aujourd’hui appelé antigène de surface de l’hépatite B fut découvert par Blumberg dans le sérum d’un aborigène australien hémophile transfusé. La particule virale B dite particule de Dane a été identifiée par Dane et al en 1970.
En 1972, Magnus et Mark ont décrit le système HBe lié à l’infectivité. Le vaccin est mis au point en 1974. [5]
2.2.2. Caractéristiques fondamentales 2.2.2.1. Classification
Le virus de l’hépatite B appartient à la famille des Hepadnaviridae et au genre Hepadnavirus. C’est un virus à ADN contrairement au virus de l’hépatite C qui est un Flaviviridae, virus à ARN. Il se rapproche des rétrovirus par son intégration dans le génome cellulaire et son mode de réplication qui utilise une transcriptase reverse. Le VHB est un virus enveloppé et résistant. [6.7.8]
2.2.2.2. Caractères physico-chimiques
L’étude structurale du VHB a montré trois sortes de particules qui sont :
• Le virus entier ou particule de Dane de 42-43nm de diamètre, sa concentration peut atteindre 109 unités/ml de sang. Il est constitué d’une enveloppe de 7nm de profondeur facilement dissociée par certains détergents, d’une capside cubique icosaédrique de 28nm de diamètre.
Cette capside contient l’ADN circulaire partiellement bicatenaire. [7.8]
• Une particule de 22nm de diamètre représentant l’enveloppe virale lipoprotéique déversée en excès dans le sang sans capside ni génome. Ces particules peuvent atteindre 109 unités/ml de sang. [8]
• Des formes tubulaires de 20-22 nm de diamètre correspondent aussi à un excès d’enveloppes virales [5.8]
Le VHB est résistant au refroidissement jusqu’à -20°C pendant plusieurs années, au chauffage jusqu’à 56°C durant 24h ; cependant, chauffé de 85 à 100°C, il perd ses propriétés antigéniques (ce qui ne correspond pas à la perte de la virulence) pendant plusieurs minutes. Le virus perd son activité sous l’action du phénol à 3-5% et de la chloramine 3%. Il résiste dans le milieu extérieur 7 jours environs et n’est pas inactivé par l’alcool ni l’éther. La particule de Dane est la seule infectieuse [6].
Figure 1: Structure du virus de l’hépatite B. Source : [9]
2.2.2.3. Organisation génomique
Le VHB possède l’un des plus petits génomes viraux. C’est le plus petit virus humain à ADN. [7]
C’est un virus à ADN circulaire partiellement bicaténaire ; cet ADN est constitué de 3200 nucléotides. Le brin long (brin L) ou encore brin négatif a une longueur fixe 3,2 kbases et forme un cercle partiellement discontinu (courte interruption). [10.11]
Le brin court ou brin positif (brin S) a une longueur variable se situant entre 50-100% du brin L. La structure circulaire du génome est assurée essentiellement par 220 nucléotides de l’extrémité 5’ de chaque brin appelée région cohésive.
L’extrémité 5’du brin S comporte un oligo-ribonucléotide lié de façon covalente, 11 nucléotides de ce dernier sont complémentaires du brin L. Cette séquence de 11 nucléotides est directement répétée (DR) à l’autre extrémité de la région cohésive. Les deux copies DR1 et DR2 seraient impliquées dans l’initialisation de la réplication virale ainsi que dans le mécanisme d’intégration dans les hépatocytes. [5] L’ADN du VHB est constitué de quatre phases de lecture ouverte conservées et situées sur le brin L. Ces phases sont partiellement chevauchantes et correspondent à 4 gènes S, C, X, P codant chacun pour une protéine.
Le génome est schématisé sur la figure 2.
Figure 2 : Structure génomique du virus de l’hépatite B [12].
La region S
Divisée en région S, préS1 et préS2 ; cette région code pour l’enveloppe virale.
Les gènes S, préS2 ont une longueur fixe. Celle du gène préS1 varie en fonction du sous-type.
Les gènes S, code pour la petite protéine de 24 kDa qui est constituée de 226 aa.
La région correspondant aux acides aminés 124 à 147 est essentielle pour la synthèse d’anticorps anti-HBs. Cette protéine est dite majeure (représente 80%
des protéines de surface). [5.8]
La région préS2 et S codent pour la protéine moyenne de 34kDa.
Cette protéine comprend en fait la protéine majeure et une terminale de 55 aa codée par la région préS2.
Les régions préS1, préS2 et S codent pour la grande protéine 39kDa.
La séquence protéique préS1, est essentielle pour la reconnaissance et la pénétration virale. Les trois protéines d’enveloppe existent sous forme glycosylée et non glycosylée. [5]
La région C
L’extrémité 3’du gène C code pour une protéine de 22KDa (p22 c) qui est la protéine de core. Dans la portion terminale 5, il existe deux séquences AUG. La séquence nucléotidique allant du premier au second triplet AUG est appelée pré C. L’antigène HBe est codé à partir du premier triplet AUG. C’est une protéine non structurale de 17 KDa.
Les premiers nucléotides de la région pré C codent pour un peptide signal facilitant l’excrétion de l’antigène HBe dans le sérum [5.6]
La région P
Cette région code pour une protéine de 82 KDa correspondant à l’ADN polymérase virale. Les produits du gène P ont une activité ADN polymérase.
Cette activité sert à la synthèse d’un nouvel ADN à partir de l’ADN pré génomique.
Les produits du gène P sont impliqués non seulement dans le mécanisme de la transcription inverse, mais aussi dans le phénomène d’encapsidation de l’ARN pré génomique servant à la transcription. [5].
La région X
Cette région code pour un polypeptide de 145 à 154 aa dépendant du sous-type.
3.1.2.4. Caractères antigéniques
Les quatre gènes S, C, P, X du VHB codent tous pour des protéines dont les plus immunogènes sont l’antigène HBs et l’antigène HBc.
L’antigène HBs
Il possède un déterminant spécifique de groupe « a » constant trouvé dans tous les virus, et divers déterminants de sous-types dont les importants sont : adw, ayw, ayr. Des mutations ponctuelles au niveau de la protéine S peuvent entraîner le passage d’un sous-type à un autre, voir la perte de la réactivité avec l’anticorps anti-HBs. [5. 6.8].
L’antigène HBc (c=core)
C’est l’antigène de capside, il est constitué par la polymérisation d’une sous unité peptidique de 22KDa [10].
Cet antigène est très immunogène et les anticorps produits sont des marqueurs précoces et durables de l’infection [14.18]
L’AgHBc n’est retrouvé que dans le foie à l’intérieur des noyaux des hépatocytes infectés et dans leur cytoplasme à une concentration moindre. Sa forme soluble, l’AgHBe est retrouvé dans le sérum. L’AgHBe est un marqueur de la multiplication virale, il peut induire les anticorps anti-HBe. [5 .8]
La protéine X
Elle est un antigène non structural et présent seulement dans les hépatocytes infectés.
Cette protéine possède des propriétés transactivatrices sur le génome viral ainsi que sur les gènes cellulaires.
L’ADN polymérase, associée à l’ADN virale est aussi antigénique. [5.6]
2.2. 3. Physiopathologie.
2.2.3.1. Cycle de multiplication du VHB dans l’hépatocyte
Le cycle du VHB est très complexe. La particule de Dane pénètre dans la cellule hépatique sans la léser (décapsidation) et l’ADN viral s’intègre dans l’ADN cellulaire. Il en résulte de l’ARN viral à partir de cet ADN. Une partie de cet ARN viral servira d’ARN messager et sera traduite en protéine (ADN polymérase, AgHBs, AgHBc, protéine X), l’autre partie se comporte en ARN
pré génomique qui sera transcrit en ADN par la polymérase qui est une reverse transcriptase. La capside contenant l’ADN du virion complet (particule de Dane) sort de l’ hépatocyte sans la léser. [8]
2.2.3.2. Lésions cellulaires.
Ce sont des lésions caractéristiques marquées surtout au début par une inflammation lymphocytaire T au niveau de la zone periportable du foie.
Cette inflammation si elle est chronique, évolue vers une fibrose hépatique puis une cirrhose. [6.8].
Effet cytopathogène du VHB est peu important, les lésions sont la conséquence d’un ensemble de réactions immunologiques à médiation principalement cellulaire, dirigées contre les hépatocytes dont la membrane exprime les antigènes de capside. Les mécanismes immunologiques sont différents selon la gravité de l’hépatite. Au cours de l’hépatite fulminante les lésions sont liées à des phénomènes humoraux, toxiques, et ischémiques. [5.6.8.]
Au stade d’hépatite aiguë elles sont dues à la sensibilisation des lymphocytes T cytotoxiques aux différents antigènes en particulier préS2 et AgHBc.
Pendant l’hépatite chronique active la réaction est dirigée principalement contre les hépatocytes où à lieu une réplication virale et exprimant sur leur membrane l’AgHBc et l’AgHBe [5].
Figure 3 : Cycle de multiplication du VHB dans l’hépatocyte [13].
2.2.4. Epidémiologie
2.2.4.1. Tropisme du virus
L’homme est le réservoir du virus. Le virus est essentiellement présent dans le sang (109 /ml de sang), mais il est détecté dans les sécrétions vaginales, le sperme, la salive, les liquides naso-pharyngés. Le virus est parfois présent dans les urines, le LCR, le liquide pleural [5.8.14]
2.2.4.2. Mode de transmission.
Voie parentérale
La transmission est essentiellement parentérale à cause de la virémie importante et prolongée [5.8. 14]. Elle se fait à travers le sang et ses produits dérivés lors des transfusions sanguines. Le risque d’hépatite post-transfusionnelle était proportionnel au nombre d’unités de sang transfusées. Actuellement le dépistage du portage du VHB dans les centres de transfusion et l’utilisation de matériel à usage unique ont permis de diminuer ce risque [5] D’autres modes de contamination parentérale existent comme la contamination accidentelle du personnel de la santé, les tatouages… [15].
La transmission sexuelle.
L’hépatite B est une infection sexuellement transmissible [5.8.14].
La transmission se fait par le sperme et les sécrétions vaginales. Il existe des comportements sexuels à risque tels que les rapports non protégés, la multiplicité des partenaires. Sacko rapporte que chez les professionnels du sexe et les homosexuels ; le risque de portage de l’AgHBs augmente avec le nombre de partenaires
Transmission mère-enfant
Elle peut être secondaire soit à une hépatite aiguë chez la mère dans le dernier trimestre de la grossesse ou dans la période néonatale, soit à une hépatite chronique [11,14].
Trepo et al ont établi que cette transmission est surtout périnatale par le contact avec le sang et les sécrétions lors du passage par la filière vaginale au cours de l’accouchement. Le risque de contamination du nouveau-né est de 90% lorsque la mère a l’AgHBe et 25% lorsqu’elle n’a pas d’AgHBe. [5,14].
L’infection du nouveau-né expose à un risque élevé de chronicité (près de 100%
d’infection chronique). [18]
2.2.4.3. Répartition géographique.
Le VHB est ubiquitaire. [6,14]
. Dans le monde 2 milliards d’individus ont été en contacte avec le virus et 400 millions en sont porteurs chroniques [19].
La prévalence varie selon les régions, on peut observer trois zones d’endémicité [14].
Une zone de basse endémicité : elle est constituée par l’Europe de l’Ouest, l’Amérique du Nord, l’Australie. La prévalence de l’infection chronique (AgHBs positif) est de 0,5 à 5% et 3 à 5% des sujets sont porteurs de l’AgHBs.
[5,14]
Une zone de moyenne endémicité : Ayant 2 à 7% de porteurs chroniques de l’AgHBs, 20 à 50% des sujets ont des anticorps anti-HBs. Elle est représentée par le basin méditerranéen, le moyen orient, l’Amérique du Sud, l’Europe de l’Est et l’ex-URSS.
Une zone Hyper-endémique : Constituée par la chine, l’Asie du sud-est, l’Afrique subsaharienne. La prévalence de l’infection est de 8 à 15%, 70 à 95%
des sujets ont des anticorps anti-HBs. Dans cette zone la contamination a lieu essentiellement à la naissance ou pendant l’enfance. Ce qui explique cette haute prévalence [5].Une étude réalisée au Mali en 1980 a donné les résultats ci-après : 16,5% d’AgHBs, 34,15% d’anti-HBc, 46,6% d’anti-HBs. A partir de ces résultats, 90% de la population étaient au moins porteurs d’un marqueur [21].
En 1997, la prévalence de l’ AgHBs était de 14% dans la population des femmes enceintes et le risque de transmission mère-enfant était de 37,5% [16].
En 2002 Tembely [25], en 2003 Guindo [22], et en 2004 Tangara [26] avaient eu des fréquences de 15,25%, de 14,9% et 15,72% chez les donneurs de sang au
centre national de transfusion sanguine de Bamako. Toutes ces études ont montré que le Mali est un pays à forte endémicité.
Tableau I : Niveau de prévalence du portage chronique selon les zones géographiques du monde [4,20].
Classification Portage chronique Zone géographique Forte prevalence 5 à 10% Afrique, Asie du
Sud-Est Prévalence
intermédiaire
2 à 5%
Italie, Afrique du Nord, Espagne, Grèce, Japon
Faible prevalence 0,30% Europe du Nord, USA
Figure 4 : Distribution mondiale de la prévalence du VHB [20]
2.2.4.5. Groupes à risques
Ces groupes sont liés aux différents modes de contamination du VHB.
Les polytransfusés, les hémophiles, les hémodialysés, et les toxicomanes intraveineux présentent un haut risque.
Selon Trepo et al, plus de 80% des toxicomanes intraveineux ont au moins un marqueur du VHB [17]
. On peut aussi parmi les groupes à risque citer, l’enfant né de mère AgHBs positif et le personnel de santé chez lequel l’hépatite B est considérée comme une maladie potentiellement professionnelle.
L’entourage familial d’un porteur chronique, les sujets à partenaires sexuels multiples et les homosexuels présentent aussi le risque important [14.21]
2.2.5. Marqueurs biologiques de l’hépatite B.
2.2.5.1. Marqueurs non spécifiques
- Transaminases : l’élévation des transaminases (ALAT : Alanine Amino Transférase et ASAT : Aspartate Amino Transférase) permet de mettre en évidence une cytolyse hépatite. Leur valeur est entre 10 et 100 fois supérieures à la normale dans les hépatites aiguës. Au cours de l’hépatite chronique l’élévation est modérée (1 à 5 fois à la normale). L’ALAT est presque toujours supérieure à l’ASAT en l’absence de cirrhose, l’inverse se produit si c’est la cirrhose [5, 6].
- Taux de prothrombine (TP): ce taux est abaissé lors de l’hépatite sévère, (TP< 50%). Un taux< 30% définit l’hépatite fulminante.
La VS est élevée et le taux de lymphocytes est abaissé en cas d’hépatite sévère.
2.2.5.2. Marqueurs spécifiques
Les Antigènes
- Antigène HBs : La présence de l’AgHBs dans le sang signale l’infection par le VHB. Il est détectable dans le sérum des sujets infectés entre 2 et 6 semaines après contamination.
La persistance au-delà de six mois de l’AgHBs témoigne une infection chronique [6.7.14].
Sa négativation dans le sérum permet de prédire une évolution favorable à la guérison [5 .6]
-Antigène HBc : Il est le témoin de la réplication virale dans le tissu hépatique d’un sujet atteint du VHB.
-Antigène HBe : détectable dans le sérum, sa présence témoigne une phase de réplication virale intense et d’une contagiosité importante. [8.14].
La persistance de cet antigène plus d’un mois est un indice précoce de passage à la chronicité [16].
-ADN et ADN polymérase : sont aussi des marqueurs de la réplication virale.
Les Anticorps :
- Anticorps anti-HBs : Au cours d’une hépatite aiguë l’anti-HBs devient détectable lorsque l’AgHBs disparaît. Il confère une immunité protectrice vis-à-vis d’une réinfection par le VHB. Son apparition signe l’arrêt de la réplication virale et témoigne une infection ancienne en absence de vaccination [5].
Anticorps Anti-HBc : Ce sont des marqueurs très précoces de l’infection.
Associés à l’AgHBs, ils traduisent une infection en cours [27].
Ils sont de deux types : IgM Anti-HBc et IgG Anti-HBc, ce qui permet de dater l’infection.
L’IgM Anti-HBc détectable pendant la phase préictérique est le témoin d’une infection récente [6.8.14]
Les IgG Anti-HBc témoignent une infection ancienne, ils persistent pendant des années voire toute la vie.
Les IgG Anti-HBc représentent les meilleurs marqueurs sur le plan épidémiologique.
-Anticorps Anti-HBe : Il apparaît dans le sérum quant l’AgHBe n’est plus détectable.
Sa présence dans le sérum témoigne l’absence de réplication virale. Cependant certains sujets anti-HBe positifs peuvent avoir une infection virale active surtout si l’AgHBs ou ADN virale existe dans l’hépatocyte [5.27]
Tableau II: Illustration des différents cas possibles d’évolution de l’
Hépatite virale B : les marqueurs associés aux différents types de patients [6]
-Figure 5 : Evolution des Antigènes et Anticorps en fonction du temps le cas d’un malade « normale » [8].
Evolution des marqueurs viraux de l’Infection au virus de l’hépatite virale B.
Titre AC/AF
Titre Ac/Ag
2.2.6. Les moyens de diagnostic sérologique des infections par le Virus de l’Hépatite Virale B
2.2.6.1. Tests de dépistage sérologique de l’Ag HBs
Le diagnostic virologique de l’infection à VHB est avant tout un diagnostic sérologique basé sur la recherche d’antigènes par méthode immuno-enzymatique (ELISA) ou autre méthode immunologique de sensibilité équivalent. Le diagnostic de l’infection repose chez l’adulte sur la détection des Ag HBs.
Le développement des techniques de biologie moléculaire ne permet pas pour l’heure de remplacer les techniques sérologiques qui restent partout dans le monde les techniques de références pour le dépistage des infections à VHB.
Il existe désormais de très nombreux tests disponibles pour la détection de l’infection. Ils reposent sur des Ag HBs concepts différents (tests indirects, tests sandwich, tests compétition,…), des supports différents (microplaques, microparticules, immunofiltres,…), une technologie différente (technologie microplaque classique, automates, tests unitaires,…). A coté des tests ELISA,
des tests d’agglutination (particules de gélatine sensibilisées) sont également disponible.
Le dépistage de l’Ag HBs s’effectue le plus souvent par des tests dits ELISA (Enzyme- Linked- Immunosorbent- Assay) ou par des tests rapides utilisant comme antigènes des lysats viraux ou des protéines recombinantes ou synthétiques.
La recherche de l’AgHBs faite par VIDAS® PC (bioMérieux® France)
Vidas® HBs Ag Ultra (HBs) est un test qualitatif et quantitatif, automatisé sur les instruments VIDAS, permettant la détection de l’antigène de surface du virus de l’hépatite B (AgHBs) dans le sérum ou le plasma humain par la méthode ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay).
La sensibilité analytique de VIDAS PC est inférieure 0,15ng/ml d’AgHBs et sa spécificité est 100%.
Principe du test :
Le test Vidas HBs Ag Ultra utilise la technique ELFA automatisable sur le système Vidas. Ce dosage peut être effectué selon 2 protocoles : protocole long HBL (90 minutes), protocole court HBS (60 minutes).
Le cône à usage unique sert à la fois de phase solide et le système de pipetage.
Les réactifs de la réaction immunologique sont prêts à l’emploi et pré répartis dans la cartouche.
Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l’instrument. Elles sont constituées d’une succession de cycles d’aspiration / refoulement du milieu
Toutes les étapes du test sont réalisées automatiquement par l’instrument. Elles sont constituées d’une succession de cycles d’aspiration / refoulement du milieu