Quantifications sub-synaptiques en CLEM super-résolutive

Dans le cadre de l’étude intégrée des régulations synaptiques, mon travail de thèse permet à présent de mettre en place des protocoles de CLEM super-résolutive (sCLEM ou super-CLEM) pour quantifier conjointement la composition moléculaire et les paramètres ultrastructuraux de synapses identifiées in vivo, avec plusieurs applications directes envisagées au sein du laboratoire.

1. Super-CLEM en circuits intacts

Disséquer le détail submicrométrique des régulations synaptiques permet de comprendre les mécanismes de la plasticité synaptique. La sCLEM permet de résoudre la nano-organisation synaptique

in vivo de façon quantitative car elle permet de compter, en SMLM, le nombre exact des composants moléculaires de synapses caractérisées en EM au niveau ultrastructural. Par exemple, comparer l'évolution conjointe de la distribution des récepteurs synaptiques et de l'ultrastructure de la PSD permettrait de comprendre les variations de la conductance synaptique au cours de la plasticité structurale.

Mes travaux actuels visent à adapter mon protocole CLEM pour observer des synapses identifiées en SBEM et en SMLM. Cependant, l'acquisition SMLM en tranches corticales impose certaines contraintes techniques supplémentaires :

• La SMLM nécessite d’utiliser des sondes photo-activables, qui sont plus difficiles à intégrer dans une stratégie de marquage in vivo que des fluorophores standard.

• La quantification moléculaire en SMLM requiert un grand nombre de photons de fluorescence alors le RSB est typiquement faible en SMLM dans les tissus diffusants.

• L'information 3D, accessible en microscopie confocale, fait défaut en SMLM standard. J'ai entrepris des travaux préliminaires pour lever ces verrous technologiques.

1.1. Adaptation de la stratégie de marquage in vivo

L'acquisition SMLM nécessite d'utiliser des sondes moléculaires photo-activables, qui peuvent être classées en deux catégories : des protéines fluorescentes pour les acquisitions PALM (Photo-Activated Localization Microscopy), ou des fluorophores synthétiques, souvent introduits par immunomarquage, pour les acquisitions de type STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy). Afin de conserver une stratégie de marquage in vivo par IUE, et pour limiter les dommages ultrastructuraux causés par l'immunomarquage de tranches de tissu, nous avons choisi d'utiliser les protéines fluorescentes photo-activables, qui sont de deux types principaux. Les sondes photo-commutables, comme la protéine

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Dronpa, passent en général d’un état fondamental éteint à un état excité fluorescent (off/on) par stimulation lumineuse. Ces sondes ne sont visibles qu’après photoactivation, ce qui complique l’observation de protéines dont on ne connaît pas a priori la distribution dans l’échantillon. Les protéines photo-convertibles transitent quant à elles entre deux états fluorescents, et sont donc repérables avant la photo-activation. Cependant, leurs spectres d’émission et d’absorption sont dédoublés, ce qui limite le nombre et le type de sondes supplémentaires qu'il est possible de combiner dans un même échantillon sans recouvrement spectral entre les différentes sondes.

Nous avons cherché à définir quel type de sonde conviendrait le mieux à notre stratégie de marquage, où des neurones marqués par IUE expriment un marqueur cytosolique et une sonde synaptique photo-activable. Si la sonde est photo-commutable et recrutée par les synapses excitatrices, elle est présente dans la quasi-totalité des épines dendritiques des neurones d'intérêt, et il est aisé de cadrer l'acquisition PALM : n’importe quelle épine dendritique électroporée contient a priori la sonde. En revanche, si la sonde photo-commutable est recrutée par les synapses inhibitrices, ou distribuée de façon inconnue a priori, l'acquisition en PALM est suboptimale car elle requiert d'observer des champs de vue au hasard et de retrouver les ROIs rétrospectivement. À l'inverse, les sondes photo-convertibles sont visibles dans les deux cas considérés : elles permettent d’étudier à la fois les synapses excitatrices et inhibitrices, au prix d’une plus grande occupation du spectre visible. Nous avons choisi d’utiliser mEos4b, qui est la sonde PALM photo-convertible de plus forte brillance disponible aujourd’hui.

1.2. Choix des marqueurs cytosoliques

Visualiser la morphologie dendritique sans occulter le signal mEos4b, nécessite d'utiliser un marqueur cytosolique qui émette à des longueurs d’onde distinctes de celles de mEos4b et de son état excité mEos4b*, c'est-à-dire dans le bleu ou dans le proche infra-rouge (Fig. 37). Dans un premier temps, nous avons utilisé une version cytosolique de TagBFP, la plus brillante des protéines bleues référencées sur fpbase.org, pour visualiser les dendrites électroporées et acquérir des images préliminaires de PALM dans des tranches vibratome de tissu fixé (Fig. 38). Cependant, l’utilisation combinée de TagBFP et de mEos4b n'a pas été satisfaisante : la faible brillance de TagBFP nécessite d’utiliser une forte puissance d’illumination UV pour visualiser les épines dendritiques avec un RSB satisfaisant, ce qui provoque la photo-activation prématurée de mEos4b, détériore la qualité de l’image PALM, et empêche de compter le nombre exact des sondes synaptiques.

Figure 37 : Spectres d’émission des protéines fluorescentes retenues

Spectres normalisés d’émission de fluorescence pour les protéines suivantes : TagBFP, mEos4b dans ses états fondamental et activé (mEos4b*), et iRFP670. Les spectres se recouvrent peu, ce qui permet de résoudre en fréquence les signaux des différentes sondes, avec un minimum de bruit provenant des autres sondes.

En réponse, nous avons adapté iRFP670 et iRFP720, les plus brillantes des protéines cytosoliques infra-rouges référencées sur fpbase.org, pour les utiliser comme comme marqueurs cytosoliques. Nous avons transfecté des neurones en culture, puis in utero, avec iRFP670 et iRFP720, mais ces protéines fournissent un RSB à peine suffisant in vitro pour visualiser les dendrites proximales de neurones en culture, et un RSB insuffisant ex vivo pour repérer la région corticale marquée, après perfusion et prélèvement des cerveaux électroporés. Cette stratégie de marquage nécessite le développement de sondes infra-rouges plus brillantes, non encore disponibles.

Cette étude préliminaire montre que la sonde mEos4b impose un recouvrement spectral avec la fluorescence du marqueur cytosolique, dans le cadre de notre stratégie de marquage in vivo. Nous avons décidé d’utiliser un marqueur cytosolique vert, comme EGFP, qui masque la fluorescence de l’état fondamental de mEos4b : cette situation correspond à l'utilisation d'une sonde photo-commutable, et permet l’étude en PALM des synapses excitatrices et des épines dendritiques. Nous utiliserons cette stratégie pour mieux comprendre l'ultrastructure et la nano-organisation de synapses excitatrices localisées sur des dendrites identifiées de neurones corticaux in vivo.

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Figure 38 : Résultats préliminaires en PALM sur tranches de tissu cortical

(A) Image en microscopie d’épi-fluorescence plein champ au sein d’une tranche de tissu cortical, d’une dendrite isolée exprimant TagBFP comme marqueur cytosolique et géphyrine (B) Visualisation de mEos4b-géphyrine dans l’état fondamental, sur le champ de vue présenté en (A) (C1-3) Reconstructions PALM des PSDs inhibitrices repérées en (B ; cadres jaunes). Calibrations : (A,B) 2µm (C1-3) 300nm.

2. Nano-domaines synaptiques

Le protocole de ré-inclusion sur finder grids, que j'ai pratiqué en début de thèse (cf. la partie I. des Résultats) permet l’étude de synapses identifiées en PALM/STORM et en TEM (ssTEM ou tomographie électronique) dans des tranches Tokuyasu de tissu nerveux. Au sein du laboratoire, nous mettons ce protocole en œuvre pour caractériser de façon quantitative la distribution sub-synaptique de sous-unités du récepteur de la glycine (GlyR) marquées de façon endogène par mEos4 dans des tranches de moelle cervicale (Annexe 3). Ces mesures permettront de quantifier pour la première fois le degré d’occupation des sites de liaison de la géphyrine par les GlyR dans différents noyaux des cornes ventrales et dorsales de la moelle épinière (Specht, 2019), à différents stades du développement. Par ailleurs, combiner cette approche avec la tomographie électronique nous permettra de questionner l’arrangement en nano-colonnes des complexes trans-synaptiques formés à ces synapses (Crosby et al., 2019; Yang & Specht, 2019).