2. Le Réservoir VIH
2.2. Le Réservoir en histoire naturelle
2.2.1. Quantification du réservoir
2.2.1.1. Les différentes méthodes de quantification
L’identification du meilleur marqueur du réservoir fait débat au sein de la communauté scientifique et fait l’objet de nombreuses controverses, au regard des résultats et des techniques différentes entre les études limitant toute comparaison des résultats (Figure 8).
Une des méthodes utilisées pour mesurer la fréquence de cellules latentes transportant du virus à l’état de latence, mais réplicatif, est basée sur co-culture de cellules quiescentes hautement purifiées avec les PBMC d’un donneur séronégatif et mesure le nombre d’unités infectieuses produites par million de cellules (IUPM) [247, 260]. Cette méthode est considérée comme méthode de référence par certains auteurs. La limite majeure de l'utilisation de cette technique est la nécessité d’un grand volume de sang tel qu’apporté par des cytaphérèses. En outre, la variabilité de la technique n’est pas connue (pas d’étude de reproductibilité disponible), elle ne peut pas être réalisée avec des biopsies de tissus [261] et sous-estime le nombre de virus infectieux [262].
Chez le patient traité la majorité de l’ADN-VIH est sous forme intégrée [263]. Sa quantification est sans doute le meilleur reflet du réservoir latent sans toutefois distinguer les virus compétents pour la réplication virale. La technique la plus utilisée est la Polymérase
Chain Reaction (PCR) Alu ; elle correspond à l’appariement d’une paire d’amorce à la fois avec une séquence d’un gène viral (Gag, Pol) et d’une séquence Alu conservée et répétée dans le génome cellulaire. Le standard utilisé doit contenir des séquences virales intégrées à des distances variables des séquences Alu et dans plusieurs orientations car l’amplification de fragments de tailles différentes varie. Une amplification en PCR nichée utilisant des amorces de la région LTR du VIH augmenterait la sensibilité de cette technique. La répétition de cette mesure est nécessaire pour augmenter sa reproductibilité mais est limitée par la nécessité d’obtenir des grands volumes de sang auprès des patients [263-265].
Les formes épisomales non intégrées (cercles 2 LTR, basé sur l’hybridation d’amorces sur une jonction spécifique) dont la labilité dans la cellule est discutée, sont considérées comme des marqueurs d’infection récente et témoin de réplication virale aussi leur
38 quantification est donc difficile en raison de leur faible durée de vie mais également de leur faible taille [47, 266].
En revanche, la quantification de l’ADN-VIH total par PCR en temps réel (amorces de la région LTR du génome viral, Biocentric Bandol, France) dans les PBMC quantifie les formes intégrées et non intégrées de l’ADN-VIH. Elle est simple, reproductible et réalisable à partir de divers matériel tissulaire ou cellulaire [227] et permet la quantification de l’ADN-VIH dans les différents sous populations lymphocytaires sanguines [267, 268]. Les résultats habituellement exprimés en copies/million de PBMC ou de T CD4 traduisent une fréquence d’infection cellulaire. Il y a une très forte corrélation entre l’ADN-VIH total et intégré chez les patients traités, signifiant que ce marqueur est un bon reflet du réservoir viral [263]. La quantification de l’ADN-VIH permet d’exprimer soit la fréquence d’infection par million de PBMC (ou par million de CD4 ou par million de lymphocytes TN, TCM, TTM, TEM) soit un niveau d’infection quand les résultats sont exprimés en copies par millilitre de sang total. Ce dernier mode d’expression n’est pas encore très utilisé alors qu’il a l’intérêt d’exprimer le réservoir en miroir de l’ARN-VIH (exprimé par ml de plasma sanguin) et des T CD4 (exprimés par mm3 de sang total). Les trois marqueurs sont ainsi exprimés de la même façon, par rapport à un volume de sang. Le marqueur garde sa valeur prédictive du risque d’évolution de l’infection quel que soit son mode d’expression [269].
La quantification de faibles niveaux d’ARN-VIH plasmatique est maintenant possible par technique de PCR ultrasensible permettant la détection d’une copie/ml de plasma. Les limites de cette technique sont liées au nombre élevé de PCR à réaliser pour être ultrasensible et donc au volume de plasma nécessaire (7ml). Les résultats obtenus par cette technique sont très corrélée à ceux obtenus par quantification de l’ADN-VIH total mais reflète une réplication résiduelle [270, 271]. De plus 80 % des patients traités ont une virémie aux alentours de 3 à 5 copies/ml, limitant dans le temps le suivi de la décroissance sous traitement du réservoir [258, 272]. La mesure de l'ARN du VIH associé aux cellules, comprend la quantification de l’ARN extracellulaire associée à la cellule et des ARN épissés et non épissés intracellulaires. Dans les cellules en phase latente, la production virale étant bloquée l’ARN-VIH extracellulaire associé aux cellules décroit rapidement mais il persiste une production d’ARN épissés et non épissés dans le cytoplasme, dont le type est différent de celui produit par une cellule en phase productive de virus. Ces marqueurs restent encore exclusivement du domaine de la recherche [273].
39 Les techniques de séquençage du génome viral pour l’analyse phylogénétique des virus sont des autres outils de mesure du réservoir sur le plan qualitatif par l’évaluation de la dynamique entre les compartiments au regard de la diversité virale et est complémentaire des études du niveau des réservoirs [91]. Chaque marqueur à une signification propre mais ne peut répondre à l’ensemble des questions soulevée par l’exploration du réservoir. Ces
différents outils contribueront à mieux déterminer la dynamique du réservoir.
Figure 8 : Représentation des différentes formes virales dans les cellules infectées latentes et
productives et les tests de quantification principaux de l’ADN-VIH en bleu et de l’ARN-VIH en marron d’après Lewin et al. [261].
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2.2.1.2. La quantification du VIH dans les PBMC en
histoire naturelle
Le marqueur le plus étudié car facilement réalisable en routine est la quantification de l’ADN-VIH total dans les PBMC qui permet d’estimer le «stock» de cellules infectées [221, 274]. Le niveau d’ADN-VIH dans les cellules du sang périphérique a une valeur pronostique de l’évolution immunologique et clinique indépendamment du compte des lymphocytes T CD4 et de la charge virale ARN-VIH plasmatique [221]. C’est un bon reflet du réservoir total sachant que la majorité des lymphocytes TCD4 circulants et tissulaires contiennent une copie d’ADN-VIH [275, 276]. De plus il existe une bonne corrélation en primo-infection entre les niveaux d’infection sanguins et les compartiments muqueux digestifs mesurés par la quantification de l’ADN-VIH total dans les PBMC [277]. Ainsi, le réservoir sanguin en histoire naturelle est représentatif du niveau d’infection de l’organisme.
Le niveau de réservoir mesuré est le plus élevé en primo-infection et déjà prédictif du risque de progression de l’infection [16, 17, 218, 221]. Aussi en primo-infection le niveau médian d’ADN-VIH dans les PBMC, certes élevé, présente une variabilité inter-individuelle. Il est d’autant plus élevé que le niveau de T CD4 est bas, que le niveau d’ARN-VIH est élevé et que les patients sont symptomatiques : en médiane à 3.30 log10 copies/106 PBMC [1.84-4.93] [218]. Les patients présentant un niveau de réservoir bas en primo-infection auront une évolution plus favorable de l’infection (ADN-VIH < 3.2 log cop / 106
PBMC) [221]. En l’absence de traitement, le suivi de patients pendant 24 mois inclus dans l’étude SEROCO à 6 mois de leur primo-infection a montré que l’ADN-VIH décroit progressivement dans les deux ans suivant leur inclusion pour quasiment se stabiliser en phase chronique. Dans les stades avancés de l’infection avec une immunodépression sévère, les niveaux de réservoirs redeviennent élevés (essai ANRS Etoile) [278]. Par contre les sujets asymptomatiques à long terme contrôlant l’infection depuis 8 ans dans la cohorte ANRS CO15 ALT, présentent un taux d’ADN-VIH très bas à 2.3 log /106
PBMC [279]. De même, chez les patients HIV
Controllers (HIC), le taux médian est de 1,5 log/106 PBMC avec un maximum de 2.3 log/ 106 PBMC [280].
En conclusion, il apparait que déjà en histoire naturelle, le niveau de réservoir est en lien avec le statut immuno-virologique des patients (Figure 9).
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Figure 9 : Quantification de l’ADN-VIH total dans les PBMC dans les différentes cohortes
ANRS de patients infectés par le VIH-1, d’après Lewin et Rouzioux, 2011 [261].
Le niveau de réservoir est représenté chez les patients en primo-infection, cohorte ANRS PRIMO [218, 221], en phase chronique ANRS SEROCO [281], chez les patients asymptomatiques à long terme, ANRS ALT [279], les patients HIV Controllers ANRS HIC [282] et au stade SIDA, essai ETOILE [278].