Quantification des moisissures

La biologie moléculaire a permis de comprendre que les méthodes d’identification des micro-organismes, traditionnellement fondées sur le phénotype des différents individus (capacité à dégrader tel ou tel substrat), n’étaient pas toujours fiables, puisque les résultats pouvaient varier dans le temps (perte d’une fonction métabolique, acquisition d’une résistance…). Des outils analytiques permettent d'étudier directement le matériel génétique des micro-organismes et non leur phénotype. Cette technique est ainsi devenue indispensable pour une meilleure appréciation des populations microbiennes d’un environnement donné.

Ces nouvelles techniques ne se substituent nullement aux méthodes traditionnelles dont elles constituent le complément indispensable. A partir de là, plusieurs méthodes ont donc été développées pour discriminer et/ou identifier les micro-organismes par l’analyse de l’ADN ou d’une partie de celui-ci. Ainsi, l’hybridation ADN/ADN (Martini et Kurtzman 1985) permet de comparer l’ADN génomique d’une espèce inconnue avec celui d’une espèce connue, l’électrophorèse en champ pulsé pour séparer des molécules d’ADN plus grandes que les techniques habituelles (< 50 kb) ou encore la quantification en temps réel pour étudier les phytopathogènes (Schena et al. 2004). Beaucoup de méthodes dérivent aujourd’hui de la réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction ou PCR).

La PCR

La réaction PCR permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. Au cours de la réaction P, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle.

41 Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut respecter trois étapes :

 dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin,

 borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques,

 réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin.

Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique. Pour effectuer ces transitions de température, les microtubes contenant le mélange réactionnel sont placés dans un appareil programmable : un thermocycleur. Cet appareil permet d’exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l’expérimentateur.

La réaction PCR est extrêmement rapide et ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).

La suite de la manipulation consiste à utiliser des amorces spécifiques à chaque type de microorganismes pour pouvoir amplifier des fragments de d’ADN et identifier précisément les souches.

Polymorphisme de taille des fragments de restriction (RFLP)

Le produit de PCR est, en fonction du fragment étudié, soumis à une digestion enzymatique spécifique. Le résultat de cette action enzymatique permet de différencier les souches les unes des autres en obtenant des fragments discriminatifs de faible taille moléculaire.

Amplification aléatoire de l'ADN (RAPD)

La RAPD repose sur la PCR avec des amorces de séquences arbitraires capables de s’hybrider en divers points du génome. Une seule amorce oligonucléotidique arbitraire d'une longueur d'environ 10 nucléotides est utilisée pour l'amplification de segments aléatoires d'ADN génomique et génère un profil caractéristique composé d'ADN courts de différentes longueurs. Il est également possible de combiner deux oligonucléotides ou davantage (RAPD multiplex) dans une seule PCR afin de produire des profils RADP plus fiables pour le typage des souches. Les profils RAPD sont caractéristiques des souches, leur fiabilité et leur pouvoir de discrimination dépendent des amorces.

42 Electrophorèse en champ pulsé (PFGE)

Une digestion de l'ADN génomique est effectuée avec des enzymes de restriction à sites rares de coupures. La totalité du génome est fragmentée en un nombre de fragments permettant une lecture facile et une différentiation claire entre les souches. Des cellules bactériennes de cultures fraîches sont recueillies par centrifugation et immobilisées dans des blocs d'agarose. La lyse de la cellule et la restriction de l’ADN génomique sont réalisées dans les blocs afin que l'ADN soit uniquement fragmenté de façon spécifique par l'enzyme et non de façon aléatoire par des effets mécaniques. Les blocs de gel sont ensuite déposés sur le gel d'agarose et les fragments séparés par l'électrophorèse PFGE.

PCR quantitative

La PCR quantitative en temps réel est basée sur la détection et la quantification d’un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons générés pendant la réaction de PCR. Cette technologie exploite une propriété inhérente à la PCR : plus il y a de molécules cibles à l’origine, plus le nombre de cycles d’amplification nécessaires pour atteindre un nombre déterminé de molécules amplifiées sera réduit. Autrement dit, le nombre de cycles nécessaires pour que la fluorescence atteigne une valeur seuil est inversement corrélé au nombre de molécules cibles à l’origine. Étant donné qu’elle utilise généralement des systèmes en tubes fermés et que la quantification ne requiert aucune manipulation post-amplification, les problèmes de contamination post-PCR par les amplicons sont significativement réduits. Le processus complet est automatisé du début à la fin rendant cette technologie très performante pour des applications d’analyses à grande échelle. En comparaison avec la PCR semi-quantitative, elle permet d’obtenir une grande précision de calcul, une standardisation des expériences et une meilleure sensibilité.

La spectroscopie en proche infrarouge (SPIR)

La spectroscopie en proche infrarouge est une technique analytique basée sur le principe d’absorption des rayonnements infrarouges par la matière organique. Cette absorption étant liée à la composition chimique des échantillons, une estimation peut être faite en mesurant l’absorption de lumière par l’échantillon. Cette mesure est réalisée avec un spectromètre en transmission (par mesure de la lumière au travers d’un échantillon fin) soit par réflexion (en mesurant la lumière réfléchie par un échantillon épais). Cette technique présente de nombreux avantages car elle est rapide, non destructive, ne nécessite pas une grande quantité d’échantillon et est peu onéreuse. Le spectre obtenu est caractéristique d’un échantillon car il regroupe des

43 informations (quantité et caractéristiques) de chacun de ces constituants organiques (protéines, matières grasses, fibres, etc.).

Cette richesse d’information constitue l’avantage et l’inconvénient de l’analyse SPIR ; beaucoup d’informations sont présentes dans un spectre, mais il faut faire appel à des méthodes statistiques complexes qui vont permettre de relier les spectres et les analyses chimiques. Il s’agit de la phase de calibration qui fournit des équations spécifiques d’un paramètre chimique pour une matière première donnée.

La spectroscopie en proche infrarouge a été utilisée pour quantifier les moisissures par une prédiction de la chitine, un polymère de la glucosamine constituant de la paroi cellulaire. Les spectres sont collectés à partir de foin contaminé par des moisissures. Les concentrations en chitines sont comprises entre 75 et 710 µg /g MS et sont similaires au taux retrouvé dans d’autres produits contaminés. Un spectre de glucosamine commerciale a permis de mettre en place une équation pour prédire efficacement la teneur en moisissures présentes dans le foin. Cette technique peut aussi être appliquée pour la détection des métabolites produits par les moisissures mais avec une phase développement de base de données de calibration qui pourrait être lourde et coûteuse mais aussi peu applicable en cas de crise.