Quantification de l’intégration du génome viral dans les cellules épithéliales

Les muqueuses intestinales et utérines représentent les sites majeurs de la réplication du VIH (Lackner and Veazey 2007; Brenchley and Douek 2008). L’infection virale productive nécessite l’intégration du génome viral dans le génome de la cellule hôte (Farnet and Bushman 1996). Nous avons démontré dans la section précédente que les cellules épithéliales HT-29 et A549 expriment à des niveaux faibles, voire indétectables CD4, CCR5, et CXCR4. Toutefois, d’autres récepteurs du VIH à la surface des cellules épithéliales ont été décrits, comme le GalCer, les glycosphingolipides de surface et les lacto-céramides sulfatés (Furuta, Eriksson et al. 1994; Bomsel and Alfsen 2003). Ces récepteurs peuvent rendre les cellules épithéliales permissives à l’infection. Nous avons ainsi testé la susceptibilité des cellules épithéliales intestinales HT-29 et alvéolaires A549 à l’infection par la souche virale NL4.3BaL, une souche connue pour son utilisation de CCR5 pour l’entrée dans les cellules cibles (tropisme R5). Le choix de ce type de souche virale est justifié par le fait que les souches virales à tropisme R5 sont les souches transmises de façon sélective lors de la transmission muqueuse du VIH (Grivel, Shattock et al. 2011). Les cellules MAGI ont été utilisées comme contrôle positif de permissivité virale. Les niveaux d’ADN viral intégré dans les cellules ont été quantifiés par PCR en temps réel en utilisant des amorces spécifiques (voir Matériel et Méthodes).

Cette série d’expériences nous a permis de détecter, comme anticipé, un taux considérable d’intégration virale dans les cellules MAGI (Figure 14). L’intégration de l’ADN viral a été indétectable dans les cellules HT-29, alors que, de façon surprenante, des niveaux modérés d’ADN viral intégré ont été détectés dans les cellules A549 (Figure 14). En conclusion, nos résultats démontrent que les cellules épithéliales alvéolaires A549, et non pas les cellules épithéliales intestinales, sont permissives à l’infection par le VIH à tropisme R5. Le mécanisme par lequel le virus entre dans les cellules A549 reste à élucider par des études futures prévues au laboratoire.

66

4.4 Effet du VIH-1 sur le rôle des cellules épithéliales dans l’immunité des muqueuses

4.4.1 Effet du VIH-1 sur la production de CCL20 et CXCL8 par les cellules épithéliales intestinales versus alvéolaires.

La déplétion des lymphocytes Th17 du GALT conduit à une forte translocation microbienne causant l’activation immunitaire chronique et l’évolution vers le stade SIDA (Brenchley, Price et al. 2006). La chimiokine CCL20 est la principale responsable de l’attraction des cellules Th17 dans les muqueuses. Des études précédentes ont démontré que l’infection par le VIS induit une diminution importante du niveau d’ARNm de la chimiokine CCL20 et CXCL8 dans l’intestin des macaques rhésus (Raffatellu, Santos et al. 2008). Ces résultats suggèrent un effet direct du VIS sur la production de CCL20 et CXCL8 par les cellules épithéliales intestinales (Raffatellu, Santos et al. 2008). Malgré le fait que les cellules épithéliales intestinales sont peu permissives à une infection virale productive, il est connu que les cellules épithéliales représentent la porte d’entrée du VIH et participent à la dissémination virale par le processus de transcytose des virions (Bomsel and Alfsen 2003).

Nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le VIH peut altérer la biologie des cellules épithéliales intestinales malgré l’absence d’infection productive. Nous avons ainsi étudié l’effet de l’exposition au VIH sur la production de CCL20 et de CXCL8 par les cellules épithéliales intestinales versus alvéolaires. Les cellules épithéliales intestinales HT-29 ne produisent pas le CCL20 ou le CXCL8 de façon constitutive, alors que les cellules épithéliales alvéolaires A549 produisent le CXCL8 mais pas le CCL20 en absence de toute stimulation (Figures 15A et 16A). L’exposition des cellules intestinales HT-29 à la souche virale NL4.3Bal à tropisme R5 ou à la souche NL4.3 à tropisme X4 n’altère pas la production de CCL20 et de CXCL8 en réponse à la stimulation par les différentes cytokines (Figure 15A et 16A). Quant aux cellules épithéliales alvéolaires A549, on remarque que l’exposition à la souche X4 seulement induit la production de CCL20 (Figure 15B) et augmente de façon significative la production de CXCL8 (Figure 16B). L’exposition des cellules A549 à la souche R5 diminue la production de CCL20 en réponse à la stimulation par le TNF-α ou le TNF-α avec l’IL-17, alors que l’exposition à la souche X4 diminue la production de CCL20 en réponse à la stimulation par le TNF-α et l’IL-17 (Figure 15B). Au contraire, on observe que l’exposition des cellules A549 à la souche R5 n’affecte pas la production de CXCL8 en réponse à la stimulation par les différentes cytokines, alors que l’exposition à la souche X4 diminue la production de CXCL8 en réponse à la stimulation par l’IL-1β uniquement (Figure

67 16B). En conclusion, ces résultats obtenus in vitro sur des lignées des cellules épithéliales démontrent que l’exposition aux souches R5 et X4 du VIH n’altèrent pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les cellules épithéliales intestinales. Toutefois, l’exposition aux VIH interfère avec la capacité des cellules épithéliales alvéolaires à produire des chimiokines spécifiques pour les cellules Th17 et les neutrophiles, en accord avec la permissivité de ces cellules à l’infection par le VIH (Figure 14).

Sur la base des résultats inclus dans ce mémoires et des données publiés par notre groupe (Gosselin, Monteiro et al. 2010) et d'autres équipes (Brenchley, Schacker et al. 2004; Brenchley, Paiardini et al. 2008; Raffatellu, Santos et al. 2008), nous pensons que la déplétion des lymphocytes Th17 des tissus lymphoïdes associés à l’intestin n’est pas le résultat d’un effet direct du VIH sur la production de CCL20 par les cellules épithéliales. La diminution de l’expression de CCL20 au niveau intestinal pourrait être plutôt la conséquence d’un effet indirect causé par la déplétion des cellules Th17 suite à leur permissivité accrue à l’infection par le VIH (Gosselin, Monteiro et al. 2010), menant ainsi à un déficit en IL-17 au niveau des muqueuses et par conséquent à l’altération de la synergie entre l’IL-17 et les cytokines pro- inflammatoires pour l’induction de CCL20 (Figure 17).

68

Figure 6: Production de CCL20/MIP3α

par les cellules épithéliales intestinales, alvéolaires et utérines. Les cellules

épithéliales d’origine intestinale (HT-29; 0.5x105 _{cellules par puits), alvéolaire (A549;}

105 cellules par puits) et utérine (MAGI CD4+_CCR5+_LTR/β-Gal+_{; 10}5 _{cellules par}

puits) ont été cultivées dans des plaques Costar à 24 puits et stimulées par les cytokines recombinantes IL-1β et TNF-α (1, 10 et 100 ng/ml ; pour un volume final de 1 ml/puits) pendant 18 heures. Les surnageants ont été récoltés et la production de CCL20 a été quantifiée par ELISA. Les graphiques indiquent la production de CCL20 par les cellules épithéliales (A) HT-29, (B) A549 et

(C) MAGI. Les résultats inclus dans la figure

sont représentatifs de quatre expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

A

B

69

Figure 7: Production de CXCL8/IL-8 par les cellules épithéliales intestinales et alvéolaires. Les cellules épithéliales d’origine intestinale (HT-29; 0.5x105 cellules par puits), alvéolaire (A549; 105 cellules par puits) et utérine (MAGI CD4+CCR5+LTR/β-Gal+; 105cellules par puits) ont été cultivées dans des plaques Costar à 24 puits et stimulées par les cytokines recombinantes IL-1β et TNF-α (1, 10 et 100 ng/ml pour un volume finale de 500µl/puits) pendant 18 heures. Les surnageants ont été récoltés et la production d’IL-8 a été quantifiée par ELISA. Les graphiques indiquent la production d’IL-8 par les cellules épithéliales (A) intestinales HT-29 et (B) alvéolaires A549. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

A

70

Figure 8: Effet synergique du TNF- α et de l’IL-17 dans l’induction de la production de CCL20 par les cellules épithéliales intestinales mais pas alvéolaires. Les cellules

épithéliales HT-29 (0.5x105_{cellules par puits) et A549 (10}5 _{cellules par puits) ont été}

cultivées dans des plaques Costar à 24 puits et incubées en présence de TNF-α (1, 10 et 100 ng/ml) ou d’un mélange de TNF-α (1 et 10 ng/ml) et d’IL-17 (1 et 10 ng/ml) pendant 18 heures. Les résultats indiquent la quantification de la production de CCL20 réalisée par ELISA dans les surnageants des cellules (A) HT-29 et A549. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

***, p<0.0001, t test de Student non-apparié, TNF-α versus TNF-α/IL-17 pour chaque concentration de TNF-α séparément

A

B

71

Figure 9: Absence de synergie entre le TNF-α et l’IL-17 dans l’induction de la production d’IL-8 par les cellules épithéliales. Les cellules épithéliales HT-29 (0.5x105

cellules par puits) et A549 (105 _{cellules par puits) ont été cultivées dans des plaques Costar à}

24 puits et cultivées en présence du TNF-α (1, 10 et 100 ng/ml) ou d’un mélange de TNF-α (1 et 10 ng/ml) et d’IL-17 (1 et 10 ng/ml) pendant 18 heures. Les graphiques indiquent la quantification de la production d’IL-8 réalisée par ELISA dans les surnageants de culture des cellules épithéliales (A) HT-29 et (B) A549. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

&, cette condition n’a pas été testée

p>0.05, t test de Student apparié, TNF-α versus TNF-α/IL-17

A

B

72

Figure 10: Augmentation de l’expression du récepteur de l’IL-17 (IL-17R) à la surface des cellules épithéliales après stimulation via TNF-α et IL-1β. Les cellules épithéliales HT-29 et A549 (2.5x106 cellules par 5 ml) ont été cultivées dans des boîtes de culture T25 en présence du TNF-α (10 ng/ml) et d’IL-1β (10 ng/ml) pendant 18 heures. Les cellules ont ensuite été détachées à l’aide de Versene, marquées avec des anticorps anti-IL-17R couplés à la phycoérythrine (PE), et analysées par cytométrie en flux. Les histogrammes indiquent l’expression de l’IL-17R constitutive et après activation avec TNF-α et IL-1β à la surface des cellules HT-29 et A549. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de deux expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

73

Figure 11: Expression de l’ARN messager du récepteur CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 du VIH. L’ARN total a

été isolé des cellules épithéliales HT-29, A549, et MAGI La quantification de l’expression des gènes CD4, CCR5, et CXCR4 a été réalisée par RT-PCR quantitative en temps réel en utilisant des amorces spécifiques et le LightCycler 1.5 (Roche). L’ARN ribosomal 28S (RRN28S) a été utilisé comme gène contrôle pour la quantification. Les graphiques indiquent l’expression de (A) CD4, (B) CCR5 et (C) CXCR4 par les cellules épithéliales HT-29, A549 et MAGI CD4+CCR5+LTR/β-Gal+. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de quatre expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

A

C

B

74

Figure 12: Analyse de l’expression du CD4, CCR5 et CXCR4 à la surface des cellules épithéliales par cytométrie en flux. L’expression du récepteur CD4 et des corécepteurs

CCR5 et CXCR4 du VIH a été mesurée par cytométrie en flux à la surface des cellules HT- 29, A549 et MAGI CD4+CCR5+LTR/β-Gal+. Des anticorps spécifiques couplés à des fluorochromes ont été utilisés: CD4-Alexa700, CCR5-PE et CXCR4-PE. Des contrôles sans marquage et fluorescence minus one (FMO) ont été utilisés pour distinguer le signal positif du négatif. Les cellules ont été analysées en utilisant un cytomètre en flux BD LSRII et le logiciel BD Diva. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

75

Figure 13: Analyse de l’expression du CD4, CCR5 et CXCR4 à la surface des cellules épithéliales par microscopie confocale. Voir page suivante

MAGI HT-29

A549

CD4/DAPI

DIC Acs secondaires

B

MAGI HT-29

A549

DIC CCR5/DAPI Acs secondaires

CD4

CCR5

76

Figure 13: Analyse de l’expression du CD4, CCR5 et CXCR4 à la surface des cellules épithéliales par microscopie confocale. Les cellules épithéliales HT-29, A549, et MAGI

CD4+CCR5+LTR/β-Gal+ ont été cultivées sur des lames en verre à 8 puits (1-5x105 cellules/puits) jusqu’à confluence. Les cellules ont été marquées en surface avec des anticorps souris anti-humain (A) CD4, (B) CCR5 et (C) CXCR4 non marqués suivis d’un marquage avec un anticorps secondaire chèvre anti-souris couplé au Cy3 (coloration rouge). Les noyaux cellulaires ont été marqués au DAPI (coloration bleue). Les images ont été acquises en utilisant un microscope confocal (Carl Zeiss Cell Observer SD). Le DIC représente le contraste interférentiel différentiel, donnant une image de la structure cellulaire en relief. Merge représente la superposition de deux photographies avec deux marquages différents. La magnification des photographies est indiquée sur les figures (40X). Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de deux expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

C

77

Figure 14: Quantification de l’intégration du génome proviral dans les cellules épithéliales. Les cellules HT-29, A549 et MAGI CD4+CCR5+LTR/β-Gal+ ont été cultivées dans des plaques de 48 puits et exposées à la souche virale NL4.3BaL à tropisme CCR5 (R5) (50 ng protéine p24 du VIH/puits) pendant 48 heures. Les cellules ont été lavées, récupérées et lysées avec un tampon de lyse contenant la protéinase K. La quantification de l’ADN proviral a été réalisée par PCR quantitative nichée en temps réel, en utilisant des amorces pour les séquences Alu et des amorces spécifiques pour les régions ltr and gag du VIH. Le CD3 a été utilisé comme gène de référence pour la quantification du nombre de cellules. La quantification a été faite en utilisant la lignée des cellules ACH2, contenant une copie d’ADN proviral par cellule. Les résultats inclus dans le graphique montrent le nombre de copies d’ADN proviral par cellule. Chaque réaction PCR a été réalisée en triplicata en utilisant le LightCycler 1.5 (Roche). Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

78

Figure 15: Effet du VIH sur la production de CCL20 par les cellules épithéliales. Les

cellules épithéliales d’origine intestinale (HT-29; 0.5x105 cellules par puits) et alvéolaire (A549; 105 cellules par puits) ont été cultivées dans des plaques Costar de 24 puits et exposées à la souche virale NL4.3BaL à tropisme CCR5 (R5) et la souche virale NL4.3 à tropisme CXCR4 (X4) (50 ng protéine p24 du VIH/puits) pendant 24 heures. Les cellules sont lavées et stimulées par les cytokines recombinantes IL-1β et TNF-α (1, 10 et 100 ng/ml) ou par un mélange de TNF-α (1 et 10 ng/ml) et d’IL-17 (1 et 10 ng/ml) pendant 24 heures. Les surnageants ont été récoltés et la production de CCL20 a été quantifiée par ELISA. Les résultats indiquent la production de CCL20 par les cellules épithéliales (A) HT-29 et (B) A549 exposées ou non aux souches R5 et X4 de VIH. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

*, p<0.05 ; ***, p<0.0001 ; t test de Student non-apparié, Milieu versus R5 ou X4 pour chaque stimulation cytokinique séparément

**

*** *** ***

79

Figure 16: Effet du VIH sur la production de l’IL-8 par les cellules épithéliales. Les

cellules épithéliales d’origine intestinale (HT-29; 0.5x105 cellules par puits) et alvéolaire (A549; 105 _{cellules par puits) ont été cultivées dans des plaques de 24 puits et exposées à la}

souche virale NL4.3BaL à tropisme CCR5 (R5) et la souche virale NL4.3 à tropisme CXCR4 (X4) pendant 24 heures. Les cellules sont lavées et stimulées par les cytokines recombinantes IL-1β et TNF-α (1, 10 et 100 ng/ml) ou par un mélange de TNF-α (1 et 10 ng/ml) et d’IL-17 (1 et 10 ng/ml) pendant 24 heures. Les surnageants ont été récoltés et la production de l’L-8 a été quantifiée par ELISA. Les résultats indiquent la production de l’IL-8 par les cellules épithéliales (A) HT-29 et (B) A549 exposées ou non aux souches R5 et X4 de VIH. Les résultats inclus dans la figure sont représentatifs de trois expériences indépendantes réalisées de façon similaire sur ces mêmes types cellulaires.

*, p<0.05 ; **, p<0.001 ; ***, p<0.0001 ; t test de Student non-apparié, Milieu versus R5 ou X4 pour chaque stimulation cytokinique séparément

*** *

80

Figure 17: Modèle proposé pour expliquer les modifications induites par le VIH-1 au niveau des muqueuses : altérations de la communication entre les cellules épithéliales, les cellules Th17 et les neutrophiles. (A) Au niveau des tissus lymphoïdes associés aux

muqueuses intestinales, les monocytes secrètent des cytokines pro-inflammatoires, telles que le TNF-α et l’IL-1β, qui induisent à leur tour la production de CCL20 par les cellules épithéliales intestinales. La chimiokine CCL20 aide au recrutement des lymphocytes Th17 sécrétrices de TNF-α et d’IL-17. Ces dernières cytokines agissent de façon synergique pour induire une plus forte production de CCL20 par les cellules épithéliales. Cette synergie s’explique par le fait que le TNF-α augmente l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des cellules épithéliales. Les cellules épithéliales et les cellules Th17 produisent la chimiokine CXCL8 attractrice des neutrophiles qui ont des propriétés antivirales en produisant les défensines-α. (B) Lors de l’infection à VIH, les lymphocytes Th17 sont des cibles d’infection et leur fréquence est réduite au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales. Cela conduit à un déficit en IL-17 et CCL20 et indirectement à une altération des fonctions des cellules épithéliales dans le recrutement des cellules Th17 et des neutrophiles.

A. Homéostasie

81

82

5.1 Sommaire des résultats

Ce projet de maitrise se base sur l’hypothèse selon laquelle le VIH-1 interfère avec la capacité des cellules épithéliales (CE) intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 versus des neutrophiles. Le mémoire est divisé en trois sections portant sur 3 objectifs majeurs: (i) Explorer la capacité des cellules épithéliales intestinales versus pulmonaires à produire des chimiokines spécifiques pour les cellules Th17 versus les neutrophiles et à communiquer avec les cellules Th17 via la cytokine IL-17; (ii) Mesurer la permissivité des cellules épithéliales intestinales

versus pulmonaires à l’infection par le VIH-1 in vitro et (iii) Déterminer l’impact du VIH-1

sur la production de chimiokines spécifiques pour les cellules Th17 versus les neutrophiles par les cellules épithéliales intestinales versus pulmonaires. Pour ces études nous avons utilisé comme modèle d’étude deux lignées cellulaires d’origine intestinale (HT-29) et alvéolaire (A549) qui sont fortement utilisées dans la littérature et qui démontrent des propriétés similaires à celles des cellules épithéliales primaires (Lieber, Smith et al. 1976; Fantini, Yahi

et al. 1992 ).

Dans la première partie de ce mémoire (objectif #1), nous avons démontré que les cellules épithéliales d’origine intestinale (HT-29) et les cellules épithéliales d’origine alvéolaire (A549) produisent des niveaux similaires de CCL20, une chimiokine spécifique pour les cellules Th17 (Hirota, Yoshitomi et al. 2007; Ito, Carson et al. 2011 ), dans des conditions pro-inflammatoires (IL-1β, TNF-α.). Toutefois, ces cellules différent dans leur capacité à produire le CXCL8, une chimiokine spécifique pour les neutrophiles (Hammond, Lapointe et al. 1995), en réponse à la stimulation par les cytokines pro-inflammatoires l’IL-1β et le TNF-α. En effet, la lignée des cellules épithéliales intestinales HT-29 produit plus fortement la chimiokine CXCL8 comparativement à la lignée de cellules épithéliales alvéolaires A549. Ces résultats suggèrent que la capacité des cellules épithéliales et pulmonaires à attirer des cellules Th17 et/ou des neutrophiles aux sites d’inflammation est régulée de façon différentielle par l’IL-1β et/ou le TNF-α. Il est intéressant de noter que nous avons également démontré la capacité de l’IL-17 à agir en synergie avec le TNF-α pour induire la production de CCL20 par les cellules épithéliales intestinales mais non pas par les cellules épithéliales alvéolaires. Cette synergie entre le TNF-α et l’IL-17 s’est montrée spécifique pour la production de CCL20 car elle n’est pas observée lorsque la production de CXCL8 a été mesurée. Nos résultats démontrent que l’expression constitutive du récepteur à

83 l’IL-17 (IL-17R) est supérieure à la surface des cellules HT-29 comparées aux cellules A549. De plus, la stimulation par le TNF-α et l’IL-1β augmente l’expression de l’IL-17R de façon préférentielle à la surface des cellules épithéliales intestinales HT-29. Ceci suggère que l’expression à la hausse de l’IL-17R est au moins en partie à l’origine de l’effet synergique du TNF-α et de l’IL-17 sur la production de CCL20 par les cellules épithéliales intestinales. Ainsi, la fonction des cellules épithéliales intestinales comparée à celle des cellules épithéliales alvéolaires semble être d’avantage dépendante de la présence de l’IL-17, puisque les cellules épithéliales alvéolaires ne répondent pas à l’IL-17 malgré l’expression du récepteur à l’IL-17. Les bases moléculaires de cette différence restent inconnues. Une autre possibilité pourrait être aussi une signalisation déficiente via l’IL-17R dans les cellules épithéliales alvéolaires, et cette possibilité mérite d’être testée dans l’avenir. Malgré cette synergie sélective entre le TNF-α et de l’IL-17 dans les cellules épithéliales intestinales, les cellules épithéliales intestinales et alvéolaires produisent des niveaux comparables de CCL20 en réponse à la stimulation par l’IL-1β, suggérant ainsi la capacité similaires de ces cellules épithéliales à recruter les cellules Th17 dans des conditions pro-inflammatoires spécifiques.

Dans la deuxième partie de ce mémoire (objectif #2), nous avons démontré que les cellules épithéliales intestinales et alvéolaires expriment à des niveaux faibles, voire indétectables, le récepteur CD4 et les corécepteurs majeurs CCR5 et CXCR4 du VIH,