Quantification des champignons mycotoxinogènes

Aujourd’hui les seules techniques disponibles pour l’évaluation des risques liés à la présence des mycotoxines sont celles qui permettent le dosage direct des mycotoxines décrites dans le paragraphe précédant. Or, lorsque la mycotoxine est produite, il est trop tard. En effet, très peu de procédés disponibles sont capables d’éliminer ces mycotoxines sans altérer les produits alimentaires ou les matières premières car ces composés sont souvent résistants aux traitements chimique et thermique (Olsen et al., 2003). Dans le cadre d’une gestion s’appuyant sur la prévention, il serait primordial d’évaluer le nombre de champignons toxinogènes présents, à un moment donné, dans la matière alimentaire. La détection des champ ignons par dénombrement sur boîtes de Pétri, puis leur identification, classification et enfin la détermination de leur pouvoir toxinogène sont des étapes laborieuses, longues et qui nécessitent une expérience confirmée dans la taxonomie des champignons (Gams et Niregberg, 1989). Les méthodes immunologiques, basées sur les antigènes de surfaces, et la détermination de la quantité d’ergostérol présent dans l’échantillon par des méthodes analytiques ne sont pas spécifiques aux champignons toxinogènes (Saxena et al., 2001; Pittet et Royer, 2002).

Ces problèmes peuvent être résolus par l’utilisation de la méthode PCR (polymerase chain reaction) qui réduit le temps de détection de quelques jours à quelques heures et qui permet de détecter de façon précoce la contamination des produits alimentaires par des champignons potentiellement producteurs de mycotoxines. Ces méthodes moléculaires se basent sur l’amplification de régions particulières du génome de l’organisme potentiellement producteur et elles peuvent être utilisées pour la quantification des microorganismes. Elles sont rapides, relativement moins chères et automatisables (Russell et Paterson, 2006).

4.3.1 Les applications de la PCR dans la détection et la quantification des champignons mycotoxinogènes

Des progrès ont été accomplis depuis les 10 dernières années dans la détection et la quantification moléculaires des champignons mycotoxinogènes. Les méthodes développées dans la littérature sont basées soit sur la détection par PCR ou par PCR

Revue bibliographique

36 multiplex de certaines espèces productrices de mycotoxines, soit sur la quantification de ces espèces par PCR semi quantitative ou par PCR quantitative en temps réel.

4.3.1.1 Principe de la PCR

L'amplification enzymatique de l'ADN in vitro par PCR est l'une des techniques récentes qui est hautement sensible et spécifique. La PCR est une méthode simple composée de trois étapes (Saiki et al., 1985): 1) l’ADN est denaturé à température élevée (94°C à 96°C) pour convertir l'ADN double brins en simple brin; 2) La température est ensuite diminuée (au Tm optimale des amorces) afin de permettre aux amorces de s'hybrider à leur site complémentaire sur la séquence cible de l'ADN; 3) L'ADN est allongé sous l'action d'une ADN polymérase thermophillique par l'addition de nucléotides libres pour créer à partir de chacune des amorces une copie de l’ADN initial. La répétition de ce processus cyclique de 30 à 35 fois résulte en l'augmentation exponentielle des quantités

d'ADN de départ (2n, n = nombre de cycles). L'avantage majeur de la PCR est de

permettre (au sens théorique) la détection d'une simple molécule d’ADN à partir d'un mélange complexe d'ADN (Henson et French, 1993).

4.3.1.2 La PCR quantitative compétitive

L’une des premières méthodes de PCR quantitative mise au point est la PCR quantitative compétitive. la PCR compétitive est une méthode semi-quantitative qui est basée sur la co-amplification de la matrice d’ADN cible et de quantités données d’un ADN appelé standard interne ou compétiteur portant les mêmes sites de fixation d’amorces. Etant donné que la quantité initiale du compétiteur est connue et que les niveaux d’amplification de la cible et de l’ADN compétiteur sont les mêmes, la quantité des deux produits PCR, déterminée par électrophorèse sur gel, est représentative du taux d’ADN cible et de compétiteur présents dans l’échantillon de réaction avant l’amplification. En général, le compétiteur est un plasmide linéarisé porteur de la même séquence de nucléotides de l’ADN cible, à l’exception d’une insertion ou une délétion pour obtenir à la fin de la co-amplification deux bandes de taille différente. L’un des inconvénients de la PCR compétitive réside dans la nécessité de construire et de caractériser un compétiteur pour chaque cible à quantifier.

4.3.1.3 La PCR quantitative

La PCR quantitative (Q-PCR) repose sur la mesure continue d’une libération de fluorescence au cours des cycles de PCR reflétant l’accumulation de produit PCR. L’aspect quantitatif réside dans la détermination du Ct (« cycle threshold » ou « crossing

point ») qui correspond au nombre de cycles minimum nécessaires pour que la

fluorescence dépasse un seuil fixé au dessus du bruit de fond qui correspond au début de la phase exponentielle d’amplification. On distingue plusieurs approches de Q-PCR selon les mécanismes conduisant à la libération de fluorescence au cours de l’amplification (Figure 15):

- Emission de fluorescence par un agent intercalant (e.g. SYBRGreen® I) inséré dans l’ADN double brin

- Libération de fluorescence reposant sur :

• l’activité exonuc léase 5’-3’ de la Taq polymé rase s’exerçant sur une sonde (e.g. TaqMan®) dont la dégradation, au cours de l’élongation du fragment PCR, permet de lever l’action inhibitrice d’un quencher sur un fluorophore.

• l’hybridation d’une sonde (e.g. Molecular Beacon®, QuantiProbe™) sur sa

séquence cible sur l’ADN à amplifier conduit à la levée, par éloignement, de l’action inhibitrice d’un quencher sur un fluorophore. Lors de l’étape d’élongation, la sonde est décrochée mais non dégradée.

- Fluorescence par transfert d’énergie de résonance (FRET): lors de l’hybridation de 2 sondes (e.g. LightCycler® hybridization probes) sur leur séquence cible il y a un rapprochement des fluorophores. Lors de l’étape d’élongation, les sondes sont décrochées mais non dégradées.

Revue bibliographique

38

Figure 15 Principales techniques de la fluorescence au cours de la Q-PCR

4.3.1.4 La PCR multiplex

La PCR multiplex est l’amplification simultanée de plusieurs séquences cibles (deux au moins) dans un même tube d’amplification. Chaque amplification (dans le même tube) doit être indépendante des autres, le résultat devant être identique à celui obtenu isolément dans un tube avec un seul couple d’amorces. Chaque produit d’amplification doit avoir une taille un peu différente de celle des autres pour obtenir une distinction des bandes sur le gel. La PCR multiplex peut être aussi semi quantitative ou quantitative en temps réel.

4.4 Les régions d'ADN cibles pour la détection et la quantification