3. généralités sur le champignon utilisé :
5.2 Purification par Chromatogaphie D’Affinité sur colonne FPLC(AktaPrime plus) :
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Fig13 :Chromatographie d’affinité sur colonne de Mannose-Agarose ( 1.5cmx5cm). Colonne lavée et équilibrée avec un tampon(A) 20 mM Tris PH= 7.5,100 mM.Nacl, avec un débit de 1ml/mn. Les Protéines non spécifiques du mannose sont éluées grâce à un tampon(B) 20mM Tris PH7.5 ,1.5M Nacl. L’élution aura lieu par compétition dans un tampon à forte concentration en mannose 01 fois supérieure, soit 200 mMolaire.NB :Couleur bleue :Pour l’Absorption dans l’UV , Couleur rouge :Pour la Conductimétrie Couleur verte :Pour la Concentration
Le pic majeur désigné par la flèche (Fig13) correspond en principe à notre lectine que nous avons désigné par TrFBL0 et qui est repérée entre les volumes d’élution se situant entre les tubes 02 et 09. Pour cette deuxième étape de la procédure, après calcul des Densites optiques et des concentrations, le rendement que l’on à enregistré est de 6mg/011g de truffe de départ.
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Fig14 :Profil d’élution de l’homogénat après la chromatographie d’affinité sur gel d’agarose à N-acétylglucosamine(1.5cmx5cm). Colonne lavée et équilibrée avec un tampon(A) 20 mM Tris PH= 7.5,100 mM.Nacl, avec un débit de 1ml/mn. Les Protéines non spécifiques du N-acétylglucosamine sont éluées grâce à un tampon(B) 20mM Tris PH7.5 ,0.5M Nacl. L’élution aura lieu par compétition dans un tampon à forte concentration en N-acétylglucosamine 10 fois supérieure, soit 200 mMolaire.
Le seul Pic (fig 14) repéré à l’achèvement de la chromatographie d’Affinité sur gel d’Agarose à N-acétylglucosamine signalé par la flèche ci-dessus, est réparti entre les volumes d’élution des tubes 03 et 18,et correspond à une deuxième lectine que nous avons appelé TbFBL2.
Le rendement affiché pour cette troisième étape est de 4mg/100g de truffe.
Les lecines sont des glycoprotéines d’origine végétale, animale ou bactérienne reconnaissant spécifiquement des structures glycanniques, mais elles ne sont ni des enzymes, ni des anticorps(16). Elles possèdent généralement deux sites de fixation aux glycanes et son donc capables de précipiter les glycoconjugués (8), et d’agglutiner les cellules comme le font les immunoglobulines. Lors de la reconnaissance structurale, les chaines glycanniques interagissent via des liaisons hydrogènes avec les chaines polypeptidiques des lectines (58).Certaines lectines sont souvent et depuis longtemps utilisées comme ligands pour purifier des glycoconjugués par chromatographie d ‘Affinité ( 59). Les lectines TrFBL1 ET TrFBL2 présentent toutes les deux une forte affinité pour les groupes structuraux GlcNac (Glucose Nacétylglucosamine) et mannose ou fucose (résultats confirmés par la spectrométrie de masse qui ont été réalisés par le Consortium CFG (Consortium for Fonctional Glycomics), USA) pour TrFBL1 et TrFBL2. Ces deux dernières sont retenues en totalité dans les colonnes d’Affinité montrant ainsi qu’elles sont sous forme glycosylées. Dans notre étude, l’utilisation de la chromatographie d’Affinité a permis de séparer, après ajout du tampon mannosé ou
GlcNAc gradient
Yield =4 mg/100 g of truffle
TbFBL2
(T-Terfezia; b-boudieri; FB-fruiting body; L-lectin)
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N-Acetylglucosaminé,nos lectines des autres composés (fractions non affines).Elles seront ensuite mises en évidence par une réaction d’hémagglutination et une SDS-PAGE pour évaluer leur taux de pureté.
Controle de la Pureté par SDS-PAGE :
1 2 3 4 5 6 7 8
Fig 15 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS ( SDS-PAGE) avec 15% de gel, des sept (07) fractions retenues de TbFBL1 , après la chromatographie sur colonne ayant une affinité pour le mannose.Ligne1 :Marqueurs,Lignes2 à8 concernent les 07 fractions retenues après élution au tampon mannosé
La pureté et la masse moléculaire de la protéine ont été estimé par SDS-PAGE (en utilisant 15% acrylamide).L’estimation de la masse moléculaire de l'échantillon est effectuée en comparant avec la migration électrophorétique de la masse moléculaire standard à l'aide d'un marqueur de poids moléculaires connues (Precision Plus, protéine non coloréés, Biorad) et analysés par un logiciel de (Biorad). Le poids moléculaire de TbFBL1 a été estimé à environ 28-30kDa par ce procédé (fig15). Les échantillons, avec ou sans DTT, avec ou sans chauffage ont également été effectués sur SDS PAGE. Les résultats obtenus ont montré que TbFBL1 avait une masse moléculaire de ~ 60 kDa en conditions non dénaturantes / des conditions de non-chauffage, et dans des conditions de chauffage (100 ° C, 10 min) La masse moléculaire s’ est révélée être d'environ 30 à32 kDa (Fig16).
25 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa 150 kDa 100 kDa 250 kDa
28kDa
TrbFBL1
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1 2 3 4Fig16 : SDS-PAGE (15%) de gel montrant le profil de migration de TrFBL1 en conditions
dénaturantes et non dénaturantes.Ligne 1 :Marqueurs,Ligne2 :sans DTT et sans chauffage, Ligne 3 :ave DTT et sans chauffage,Ligne 4 :avec DTT et avec chauffage à 100°C pendant 10mn.
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1 2 3 4 5 6 7Fig 17 : : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS ( SDS-PAGE) avec 15% de gel, des six (06) fractions retenues de TbFBL2 , après la chromatographie sur colonne ayant une affinité pour le N-Acétylgucosamine.Ligne1 :Marqueurs,Lignes2 à7 concernent les 06 fractions retenues après élution au tampon B.
La pureté et la masse moléculaire de la protéine ont été estimé par SDS-PAGE (en utilisant 15% acrylamide).L’estimation de la masse moléculaire de l'échantillon est effectuée en comparant avec la migration électrophorétique de la masse moléculaire standard à l'aide d'un marqueur de poids moléculaires connues (Precision Plus, protéine non coloréés, Biorad) et analysés par un logiciel de (Biorad). Le poids moléculaire de TbFBL2 a été estimé à environ 14 kDa par ce procédé (fig15 et fig 18). Les échantillons, avec ou sans DTT, avec ou sans chauffage ont également été effectués sur SDS PAGE. Les résultats obtenus ont montré que TbFBL1 avait une masse moléculaire de ~ 60 kDa en conditions non dénaturantes / des conditions de non-chauffage, et dans des conditions de chauffage (100 ° C, 10 min) La masse moléculaire s’est révélée être d'environ 30 à 32 kDa (Fig16).
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1 2 3 4Fig18 : SDS-PAGE (15%) de gel montrant le profil de migration de TrFBL2 en conditions
dénaturantes et non dénaturantes. Ligne 1 : Marqueurs, Ligne2 : sans DTT et sans chauffage, Ligne 3 :avec DTT et sans chauffage, Ligne 4 :avec DTT et avec chauffage à 100°C pendant
10mn.