Protocole opératoire

Na cobertura verde monitorizada neste estudo, as amostras de substrato foram recolhidas junto às raízes de três plantas das espécies Sedum album (Sa), Helichrysum italicum (Hi), Armeria maritima (Am), Festuca scoparia (Fs) e de substrato (sub) sem plantas. Realizaram-se três campanhas de amostragem: 29 de maio, 3 de julho e 11 de setembro de 2017.

Nas suspensões das amostras recolhidas nesta cobertura a analise microscopia revelou a constante presença (com maior ou menor densidade) de bactérias (algumas de dimensões consideraveis), flagelados (quer microflagelados, quer euglenóides), diatomáceas, clorófitas e diversos quistos (Fig.39).

Figura 39: Bactérias (a), flagelados euglenóides (b) e diatomáceas (c) observadas em microscopia ótica de campo claro (cc, 400x) nas suspensões de amostras de substrato da cobertura verde extensiva:

A análise microscópica de suspensões do substrato recolhido junto às raízes de Sedum album (Sa) evidenciou uma considerável percentagem de protistas (Tabela 12). Em menor percentagem, os metazoários estiveram representados sobretudo por formas dos filos NEMATODA e ROTIFERA.

Tabela 12: Diversidade e abundância relativa (%) dos organismos identificados nas suspensões (em tampão fosfato salino, PBS e água purificada, H2Op) de amostras de substrato recolhido junto às raízes de três plantas da espécie Sedum album (Sa), por análise ao microscópio ótico (campo claro - cc; e contraste de fase - cf).

PBS H2Op

TAXA maio julho setembro julho setembro Ciliados (<50µm) 40,00 41,11 7,91 19,19 26,03 Halteria - - - 21,91 37,78 Aspidisca 1,36 14,23 8,45 9,29 2,43 Ciliados (>50µm) 24,66 1,28 7,73 0,24 0,21 Colpoda 12,82 8,30 22,48 8,93 0,85 Vorticella - 2,47 0,18 2,72 0,11 Stlylonichia 4,66 0,49 - 0,12 - Litonotus - - - - 0,32

Amebas com teca 11,46 11,76 33,81 15,15 23,92

Amebas nuas - 6,23 15,65 - - Heliozoa 0,19 - - 0,21 NEMATODA 4,85 0,49 3,06 - 1,90 ROTIFERA - 13,64 - 20,58 2,65 GASTROTRICHA - - - 1,87 3,49 PLATYHELMINTHES - - - - 0,11 Total de organismos mL-1 515 1012 556 1657 945

Entre as amebas com teca foram identificadas com bastante frequência formas do género Difflugia (Fig. 40). Dos ciliados, o género Colpoda (>50 µm) foi identificado em todas as amostras Sa. Organismos do género Halteria (<50 µm) só foram identificados nas suspensões das amostras em H2Op.

Figura 40: Taxa identificados em microscopia ótica de campo claro (cc) nas suspensões de amostras de substratos da cobertura extensiva: Difflugia, cc 400x (a); amebas nuas, cc 400x (b); Halteria, cc 400x (c).

As suspensões de substrato de Helichrysum italicum (Hi) também revelaram uma considerável percentagem de protistas (Tabela 13), sobretudo de ciliados e amebas com teca.

Tabela 13: Diversidade e abundância relativa (%) dos organismos identificados nas suspensões (em tampão fosfato salino, PBS e água purificada, H2Op) de amostras de substrato recolhido junto às raízes de três plantas da espécie Helichrysum

italicum (Hi), por análise ao microscópio ótico (campo claro - cc; e contraste de fase - cf).

PBS H2Op

TAXA maio julho setembro julho setembro Ciliados (<50µm) 31,71 51,33 18,55 24,44 69,46 Halteria - - 2,52 11,01 3,13 Aspidisca 0,41 4,92 19,18 0,90 9,26 Ciliados (>50µm) 26,83 1,80 0,31 4,30 0,13 Colpoda - 13,83 5,03 12,53 2,13 Vorticella 0,81 2,84 1,26 22,29 - Stlylonichia 4,07 - - - - Spathidium - - 0,31 10,74 -

Amebas com teca 26,42 15,72 44,34 9,58 9,39

Amebas nuas - 4,17 5,35 2,24 1,38

Heliozoa - 1,23 0,31 - -

NEMATODA 9,76 3.69 2,83 1,07 -

ROTIFERA - 0,47 - - 5,13

Total de organismos mL-1 246 1056 318 1117 799

As amebas com teca estiveram representadas pelos géneros Difflugia e Trinema mais abundantes nas suspensões realizadas em PBS. Os ciliados identificados como Aspidisca e Vorticella estiveram presentes em quase todas as amostras. Em julho a abundância de Vorticella foi considerável nas suspensões das amostras em água enquanto que Aspidisca foi sobretudo abundante em setembro, nas suspensões das amostras em PBS (Fig. 41). O género Spathidium foi identificado pela primeira vez com uma abundancia relativa de cerca de 11%, nas suspensões em água das amostras Hi da campanha de julho

Figura 41: Protistas identificados em microscopia ótica de campo claro (cc) nas suspensões de amostras de substrato da cobertura extensiva: Aspidisca, cc 400x (a); Trinema, cc 400x (b) Vorticella cc 400x (c).

As formas identificadas nas amostras Sa e Hi também foram observadas nas suspensões das amostras recolhidas na rizosfera de Armeria maritima – Am - (Tabela 14). As amebas com teca estiveram muito bem representadas em todas as amostras (≈9-32%).

Tabela 14: Diversidade e abundância relativa (%) dos organismos identificados nas suspensões (em tampão fosfato salino,

PBS e água purificada, H2Op) de amostras de substrato recolhido junto às raízes de três plantas da espécie Armeria

maritima (Am), por análise ao microscópio ótico (campo claro - cc; e contraste de fase - cf).

PBS H2O p

maio julho setembro julho setembro Ciliados (<50µm) 58,37 18,23 22,93 28,83 29,21

Halteria - - - - 2,72

Colpoda 5,26 - 1,27 7,66 0,25

Ciliados (>50µm) 4,31 33,50 14,97 38,51 7,67 Amebas com teca 15,79 30,54 54,78 8,47 31,93 Aspidisca 3,83 4,93 0,96 1,41 20,79 Vorticella 1,44 3,94 0,64 - 2,48 Litonotus - - - - 0,25 NEMATODA 11,00 8,87 3,50 1,01 0,25 GASTROTRICHA - - - 14,11 0,99 PLATYHELMINTHES - - - - 3,47 Total organismos mL-1 209 203 313 496 404

Menos abundantes, os metazoários estiveram representados sobretudo por formas do filo NEMATODA em todas as amostragens; nas suspensões das amostras de substrato em H2Op identificaram-se

organismos do filo GASTROTRICHA (Fig. 42), nas campanhas julho e setembro.

Figura 42:Taxa identificados em microscopia ótica de campo claro (cc) nas suspensões de amostras de substrato da cobertura extensiva: GASTROTRICHA, cc 400x (a); Aspidisca, cc 400x (b); NEMATODA cc 100x (c)

Relativamente às suspensões do substrato das raízes de Festuca scoparia (Fs) foi nas suspensões em água purificada (H2O p) que se contabilizou maior quantidade de ciliados de dimensão inferior a 50µm

Tabela 15: Diversidade e abundância relativa (%) dos organismos identificados nas suspensões (em tampão fosfato salino, PBS e água purificada, H2Op) de amostras de substrato recolhido junto às raízes de três plantas de Festuca scoparia (Fs), por análise ao microscópio ótico (campo claro - cc; e contraste de fase - cf).

PBS H2O p

maio julho setembro julho setembro Ciliados (<50µm) 35,67 17,23 41,25 75,38 79,72 Halteria - - - 1,69 1,93 Aspidisca 8,00 39,05 11,42 5,40 4,23 Ciliados (>50µm) 8,67 20,83 22,28 0,84 1,38 Colpoda - - 8,84 3,54 - Vorticella 4,33 0,92 - - 0,14 Stlylonichia 2,33 0,31 7,00 0,34 - Litonotus - - 0,37 - - Spirostomum - 0,38 - - -

Amebas com teca 27,33 9,49 7,73 11,13 5,76

Amebas nuas 10,33 9,04 - - 4,28

Heliozoa - - 0,18 - 0,41

NEMATODA 3,33 2,76 0,92 1,69 1,79

PLATYHELMINTHES - - - - 0,28

Total organismos mL-1 300 1306 543 593 725

Os géneros Trinema (amebas com teca) e Aspidisca (ciliados <50µm) foram identificados em todas as amostras Fc. (Fig. 43).

Figura 43: Organismos identificados em microscopia ótica de campo claro (cc) nas suspensões de amostras de substrato da cobertura extensiva: Aspidisca, cc, 400x (a; b); Trinema, cc 400x (c).

As suspensões do substrato (sub) não foram muito diferentes das anteriores. A destacar a presença as amebas com teca em todas as amostras, sobretudo em setembro (cerca de 30%). Como nos casos anteriores, os metazoários estiveram representados (em menor percentagem) por formas dos filos NEMATODA em todas as amostras. No mês setembro também foram observados metazoários do filo PLATYHELMINTHES (Tabela.16).

Tabela 16: Diversidade e abundância relativa (%) dos organismos identificados nas suspensões (em tampão fosfato salino, PBSe água purificada, H2Op) de amostras de substrato recolhido na cobertura extensiva num local sem qualquer espécie de planta, (sub), por análise ao microscópio ótico (campo claro - cc; e contraste de fase - cf).

PBS H2O p

TAXA Maio Julho Setembro Julho Setembro Ciliados (<50µm) 84,40 17,23 40,27 49,34 22,85 Halteria - - - 12,11 9,74 Aspidisca 0,18 39,05 8,47 6,39 0,37 Microciliados (>50µm) 8,51 20,83 4,42 2,64 4,12 Colpoda - - 1,77 0,44 16,85 Vorticella - 0,92 - - - Stlylonichia 0,71 0,31 - 0,44 - Litonotus - - - - 0,75 Spirostomum - 0,38 - - -

Amebas com teca 4,96 9,49 34,07 23,57 29,96

Amebas nuas - 9,04 7,08 2,86 2,62

Heliozoa - - - 1,10 2,25

NEMATODA 1,24 2,76 3,98 1,10 3,37

PLATYHELMINTHES - - - - 7,12

Total organismos mL-1 564 502 226 454 267

Globalmente não se registaram diferenças significativas na densidade de organismos estimada nas diferentes campanhas (Fig. 44 a) nem nas diferentes rizosferas (Fig. 44b). Como também não se registaram diferenças significativas entre as suspensões de amostras em PBS ou água, poderá não ser necessário utilizar PBS.

Figura 44: Densidade de organismos (mL-1) identificados nas suspensões, de amostras de substrato em PBSe H₂Op referentes às diferentes campanhas de amostragem (a), e às rizosferas das espécies Sedum album - Sa; Helichrysum italicum (Hi), Armeria maritima (Am), Festuca scoparia (Fs) e substrato (sub) (b). As barras de erro representam o desvio

padrão (dp) da média das amostras analisadas (n=5)

Contudo, constatou-se maior tendência para o aparecimento de metazoários nas suspensões feitas em água.

A diversidade de organismos nas amostras de substrato das diferentes rizosferas foi considerável, mas atendendo ao reduzido número de amostras analisadas, ainda não é possível associar a presença de formas específicas a determinada rizosfera. Contudo o aparecimento esporádico de certos géneros de ciliados de dimensão superior a 50 µm, bem como de certos metazoários (formas mais facilmente identificadas) sugere que essa especificidade possa realmente existir.

Capítulo IV