2 VOLET SECURITE
Les mesures de sécurité employées doivent être adaptées au produit ou à l’effluent tester. Ci-dessous les symboles de danger de la 3,4-dichloroaniline, substance de référence éventuelle.
3,4-dichloroaniline
Figure 1 : Symboles de danger de la procédure
3 PROTOCOLE
3.1 Principe
L’essai consiste à exposer des œufs nouvellement fertilisés à une série de concentrations en solution toxique et à un témoin. Le nombre de d’œufs non viables, d’éclosions et de survivants sont notés chaque jour à toutes les concentrations. Les milieux d’essais sont renouvelés quotidiennement (essai à renouvellement semi-statique). La durée de l’essai est de 10 jours. Les alevins sont nourris à partir du 5ème jour.
Tous les effets sur le comportement, les déformations sont notés et si possible quantifiés. Des mesures de longueur peuvent être effectuées en cours et/ou en fin d’essai.
La réalisation complète de l’essai, incluant la préparation (éventuellement détermination de la Cl 50 48 h), l’essai lui-même et les calculs, dure environ 3 semaines.
Les données obtenues sont utilisées pour le calcul des temps médians d’éclosion et de survie, pour le calcul, si possible de la CL 50, encadrée d’un intervalle de confiance.
Concentration entraînant un effet de p% des individus vis à vis du critère observé par rapport au témoin
Les résultats peuvent permettre de déterminer les CSEO, CMEO
3.2 Matériel et réactifs
3.2.1 Modèle biologique
Le Danio rerio est un poisson tropical de la famille des cyprinidés. Il est originaire du Gange et du Brahmapoutre dans le Golfe du Bengale et au nord de la Birmanie. Il est de maintenance aisée en laboratoire, sa petite taille (4 à 5 cm de long maximum) facilite son stockage en aquarium.
A l’âge adulte, ce poisson présente un dimorphisme sexuel facilitant le tri des sexes pour la reproduction.
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Nos géniteurs proviennent d’un éleveur spécialisé (Elevage de la Grande Rivière à Saint Forgeux (69)) et sont munis d’un certificat d’origine. Ils sont utilisés âgés de 6 et 20 mois pour obtenir les œufs nécessaires à chaque essai. La veille de l’essai on isole durant une nuit à 26 °C +- 1 °C en petits aquariums munis de pondoirs plusieurs groupes de 2 femelles et 3 mâles, tous issus d’un même lot commercial. Au matin les oeufs sont pondus en réaction au déclenchement automatique de l’éclairage (8h30) puis, peu après les œufs sont récoltés, poolés et mis en exposition préalable au stade blastula, 2 à 3 heures post-fertilisation (hpf). Les éclosions s’étalent entre 48 à 96h (à 26°C), l’organisme obtenu au bout de 4 jours étant qualifié de prolarve présente une faible mobilité et une dépendance alimentaire envers sa réserve vitelline.
3.2.2 Produits utilisés
Tableau I : produits utilisés pour la réalisation de l’eau d’essai
PRODUIT N° CAS RANGEMENT
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2 -
2H2O) 10035-04-8 Armoire 1 (E 03)
Sulfate de magnésium heptahydraté
(MgSO4-7H2O) 7487-88-9 Armoire 1
Hydrogénocarbonate de sodium
(NaHCO3) 144-55-8 Armoire 1 (C 02)
Chlorure de potassium (KCl) 7447-40-7 Armoire 1 (E 06)
3,4-dichloroaniline
95-76-1
Armoire 23.2.3 Eau d’essai
Utiliser de d’eau pure pour dissoudre les produits suivant :
294,0 mg.L-1 Chlorure de calcium dihydrate, CaCl2 · 2 H2O
123,3 mg.L-1 Sulfate de magnesium heptahydrate MgSO4 · 7 H2O
63,0 mg.L-1 Hydrogénocarbonate de sodium, NaHCO3
5,5 mg.L-1 Chlorure de potassium, KCl.
Aérer l’eau de dilution jusqu’à la saturation en oxygène saturation et ajuster la température 26 °C ± 1 °C.
A noter que toute eau naturelle de qualité équivalente peut être utilisée en remplacement de ce milieu synthétique.
3.2.4 Récipients pour l’essai
Utiliser des récipients d'une capacité d'environ 250 mL tel que des cristallisoirs, offrant une grande interface entre l'air et le milieu d'essai, munis d’un couvercle, troué en plusieurs points. Les récipients comme tout le matériel en contact avec le milieu d'essai, doit être en verre ou en matière chimiquement inerte.
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3.2.5 Régulation de température
Les essais sont effectués dans un dispositif (bain-marie) ou une armoire d'incubation pouvant être régulé à 26°C + 1°C et dont la photopériode peut être modifiée. Cette température est contrôlée, dans les récipients d’essai au moins une fois par jour, de préférence au moment du renouvellement des solutions
3.2.6 Appareils de mesure de paramètres physico-chimiques
pH-mètre,
oxymètre
conductimètre
3.3 Mode opératoire
3.3.1 Solution mère de la substance d'essai
La solution mère de la substance à expérimenter peut être préparée à l'avance dans les limites reconnues de stabilité dans l'eau. A défaut d'informations sur cette stabilité, la solution mère est préparée le jour de l'emploi. Une quantité connue de substance est dissoute dans un volume connu d'eau de dilution.
3.3.2 Solutions d'essai
Les solutions d'essai sont préparées par dilution de la solution mère ou par dissolution directe de la substance d'essai dans de l'eau de dilution afin d'obtenir les concentrations nécessaires.
Les effluents sont conservés et remis en température. Les traitements préalables des effluents (décantation, filtration, centrifugation) sont estimés en fonction de leur nature. Ils sont dilués avec de l'eau de dilution.
Dans le cas de substances mal solubles dans l'eau, les solutions mères peuvent être dissoutes ou dispersées par tout moyen approprié incluant l'utilisation d'ultrasons et l'usage de solvants non toxiques, à la concentration utilisée, pour les poissons.
Si un solvant est utilisé, sa concentration doit être la même dans chacune des solutions d'essai et ne doit pas excéder 0,1 ml.L-1.
Préparer, à partir de la solution mère de la substance à étudier ou à partir de l'effluent, on réalise au moins 5 solutions d'essai, de concentrations en progression géométrique, par exemple : 100, 10, 1, 0,1 et 0,01 mg.L-1 pour une substance. Pour un effluent la concentration maximum ne dépassera pas 90%. On tiendra compte pour établir la gamme de concentration des données de toxicité aiguë éventuellement disponibles
Un essai témoin supplémentaire contenant le solvant à sa concentration dans les solutions d'essai doit être effectué.
Dans le cas où un solvant est utilisé, préparer avec de l'eau de d’essai une solution de solvant à une concentration égale à la concentration de solvant présente dans les solutions d'essai.
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Toutes les solutions utilisées doivent être amenées à 26°C + 1°C avant tout contact avec le matériel biologique.
3.3.3 Substance de référence
En l'absence d'une expérience suffisante de notre laboratoire, aucune substance de référence n'est recommandée. Cependant on peut signaler le 3,4-dichloroaniline qui est recommandé par l’ISO :
Pour une solution mère de r(C6H5Cl2N) à 100 mg.L-1 : agiter 0,05 g de dichloroaniline dans 500 ml d’eau d’essai durant 24h puis Ajuster le pH à 7,0. Gardée à l’obscurité, au réfrigérateur, cette solution se conserve 6 mois.
3.3.4 Préparation des récipients d'essai (incubateurs)
Disposer d'au moins 18 récipients d'essai qui recevront chacun 200 ml de solution.
On préparera au moins trois réplicats de chacune des solutions d'essai. L'eau de dilution correspondra à au moins 3 récipients témoins. Eventuellement, la solution de solvant correspondra à au moins 3 récipients témoins de solvant
.
3.3.5 Mise en incubation
A partir d’un pool d’œufs tout juste pondus de moins de 4 heures, prélever environ 50 œufs à l'aide d'une pipette à bout large et les déposer les dans chaque récipient d'essai en apportant un minimum d'eau (J0
).
3.3.6 Incubation
Déposer les récipients d'essai contenant les œufs sous la lumière dans l'enceinte ou l’armoire thermorégulée ;
au bout de 24 heures (J1), à l'aide d'une pipette, ôter les œufs non fécondés (ces œufs apparaissent blancs quand on place le récipient sur un fond sombre), noter leur nombre;
ramener le nombre d’œufs fécondés à un maximum de 30 par récipient d'essai.
jusqu'à la fin de l'essai (fin du 10ème jour d'incubation), chaque jour, après avoir noté la température, le pH, la teneur en oxygène dissous dans chaque récipient renouveler le milieu, par une aspiration douce, permettant de renouveler 95 % du milieu sans trop traumatiser les embryons.
chaque jour, le nombre d'alevins éclos, d’œufs non viables et d'alevins morts sont consignés et enlevés à l'aide d'une pipette.
à partir du 6ème jour, les alevins sont nourris 2 fois par jour à l'aide d'aliments artificiels déshydratés du commerce (100µ < ø < 2100µ) à raison d'environ 0.5 mg/jour par larve. Une surcharge alimentaire entraînant rapidement une baisse du taux d'oxygène dissous, la quantité de nourriture est à adapter en fonction du nombre d'alevins restants.
Nombre de larves par récipient d’essai
1 à 10 11 à 20 21 à 30
Quantité distribuée (mg) 5 10 15
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à partir du 6ème jour, les alevins reçoivent en plus des nauplies d'artémia (Artemia salina), dont les œufs ont été mis en éclosion depuis moins de 48 heures à 26 °C
le dernier jour, le nombre d'alevins vivants est déterminé, toutes les observations sur le comportement et les malformations sont notées, la mesure de la taille individuelle des alevins peut être effectuée par analyse d'image
3.3.7 Mesure des taux de survie
On considère qu'un embryon est vivant s'il ne présente aucune trace manifeste de précipitation des protéines, notamment dans le système nerveux ou dans le vitellus.
On s'assure de la viabilité des embryons par l'observation de leur capacité de mouvement ou tout autre procédé conduisant au même résultat.
La détermination du taux d'éclosion peut s'effectuer à l’œil nu, en plaçant les récipients d'essai au-dessus d'une platine lumineuse, ou, sur un fond clair.
Le dénombrement des embryons éclos et des alevins vivants peut être facilité en procédant par transferts successifs d'un petit nombre d'individus dans un récipient intermédiaire d'où ils sont aussitôt reversés dans le récipient d'essai.
Le dénombrement des embryons et des alevins est pratiqué de préférence, au moment du renouvellement des solutions.
Dans chaque récipient d'essai :
déterminer, le 1er jour d'incubation (J1), le nombre total (N0) des œufs mis à incuber, le nombre d’œufs non fécondés (Nf), le nombre d’œufs éliminés (Ne), le nombre d'embryons vivants restants (N1) = (N0-(Nf+Ne))
noter tous les jours le nombre d'embryons éclos (Nn), le nombre d’œufs non viables, et le nombre d'alevins morts.
quand tous les embryons viables sont éclos, déterminer le % d'éclosion par le rapport Nn/N1*100
à la fin de l'essai, 10ème jour d'incubation, dénombrer les alevins vivants (N10) et calculer le pourcentage de survie N10/N1*100.
3.4
Expressions des résultats
3.4.1 Validité de l'essai
Les résultats sont considérés comme valables si, dans chacun des récipients témoins:
le pourcentage d’œufs non fécondés est inférieur à 30%,
la survie des embryons en fin d'expérience est supérieure à 90%
le temps maximal d'éclosion est inférieur à 5 jours.
la teneur en oxygène dissous dans les récipients témoins est toujours restée supérieure à 60% de la saturation.
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3.4.2 Résultats
Déterminer :
la CMEO: solution d'essai la plus élevée dans les conditions de l'essai n'ayant pas provoqué d'effet ;
la CSEO: plus faible solution d'essai dans les conditions de l'essai montrant un effet .
les ICp : Concentration entraînant un % d'inhibition (survie, croissance,...) donné par un calcul statistique approprié