Protocole expérimental

Le but de notre étude réside dans la caractérisation de la fluorescence de molécules isolées présentant une absorbance dans l’UV. Nous avons choisi d’étudier le cas de la résine mastic eu égard aux travaux dont cette résine a déjà fait l’objet. A cet effet, nous avons sélectionné des échantillons dans trois états de dégradation différents : l’état frais, dégradé thermiquement et vieilli naturellement pendant une centaine

VI.1.1 Préparation des échantillons

La séparation des constituants d’une résine par chromatographie liquide nécessite l’injection d’échantillons sous forme liquide. La mastic étant une résine naturelle, la préparation des différents échantillons a été effectuée par solubilisation dans du méthanol. En effet, la partie triterpénique considérée dans cette étude se situe au sein de la partie résinique qui est soluble dans l’alcool. Dans le but d’obtenir des résultats comparables et reproductibles, un protocole de préparation d’échantillons a été élaboré. La solution méthanolique est préparée à partir de 0,5g de résine brute solubilisée dans 3ml de méthanol de grade analytique (Merck). Après dix minutes dans un bain ultrasons, suivi d’une centrifugation, la partie surnageante est prélevée au moyen d’une seringue munie d’un filtre 0,45 µm.

VI.1.2 Etablissement d’un gradient d’élution

La séparation des molécules a été effectuée au moyen d’une chromatographie liquide haute performance (CLHP) couplée à un détecteur spectrophotométrique, qui permet de visualiser le spectre d’absorption des composés séparés, ou à un spectromètre de masse, qui permet l’identification des composés séparés, comme le montre la figure 1. Ainsi ne sont sélectionnées que les seules fractions contenues dans la résine qui fluorescent.

Figure 1 : Système expérimental mis en place pour effectuer la séparation des molécules constitutives de la résine mastic présentant une absorption dans le domaine de l’UV et permettre leur identification

Afin de pouvoir comparer la composition de la mastic en fonction de son état de dégradation, nous avons mis au point un gradient d’élution réalisant un compromis entre une séparation satisfaisante des molécules et l’élution de la totalité des molécules tout au long du temps de l’analyse.

Pour ce faire, nous avons utilisé deux éluants d’analyse : de l’eau ultra pure à laquelle on ajoute 0,1% d’acide formique (en volume) et de l’acétonitrile à laquelle on ajoute également 0,1% d’acide formique. Le gradient d’élution permet de faire varier au cours du temps la proportion des deux éluants de la phase liquide. Cette variation modifie progressivement l’affinité de chaque composé avec la colonne et engendre donc la migration des composés à des vitesses différentes, ce qui permet la séparation des molécules. Le détail du gradient mis au point est décrit dans le tableau 1.

CLHP

Temps (mn) 0 35 50 52 54 Eau + Acide Formique

0,1% ( en % v/v) ^{60 20 0 0 60}

Acétonitrile+Acide Formique 0,1% (en %)

40 80 100 100 40

Tableau 1 : Gradient d’élution utilisé pour l’étude d’extrait méthanolique de résine mastic fraîche, vieillie thermiquement et ancienne.

VI.1.3 Séparation des fractions par absorbance UV

Le domaine des longueurs d’onde d’absorption du détecteur spectrophotométrique se situe entre 210 et 800 nm. Une visualisation en trois dimensions du chromatogramme, dont un exemple est présenté sur la figure 1 bis, permet de sélectionner une longueur d’onde d’absorption d’étude, à laquelle va s’opérer la sélection des fractions.

λabs (nm) temps (mn) In ten sité (u .a)

Ainsi, une coupe à une longueur d’onde d’absorption déterminée selon l’axe des temps permet de visualiser un chromatogramme, et une coupe à un temps donné selon l’axe des longueurs d’onde permet d’obtenir le spectre d’absorption du soluté dans l’éluant à un instant déterminé.

On constate que l’absorption des molécules contenues dans la résine mastic fraîche est beaucoup plus intense lorsqu’elles sont éclairées sous 210 nm que par des longueurs d’onde du domaine visible, comme le montre la figure 1bis pour les différents constituants. Il en est de même pour la résine solubilisée mais non séparée, comme l’illustre la figure 2, et ce pour différentes dilutions. Dans ce dernier cas, une solution méthanolique de résine fortement concentrée est nécessaire pour visualiser l’absorption de la résine dans le domaine du visible. Ceci est illustré sur la figure 2 par la saturation du pic d’absorption à 220 nm pour toute la gamme de dilution représentée. 200 400 600 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 absorbance λ (nm) dilution 1: 1,5 g résine/ml dilution 1 / 10 dilution 1 / 100 dilution 1 / 1000 dilution 1 / 10000

Figure 2 : Spectres d’absorbance d’une solution de résine mastic diluée dans du méthanol en fonction de la concentration de résine

La couleur jaune de la solution, illustrée sur la figure 3, traduit l’absorption de la lumière dans la zone des basses longueurs d’onde du domaine visible. Cette absorption est néanmoins négligeable par rapport à l’absorption entre 210 et 280 nm, comme le montre également la figure 2.

Figure 3 : Solutions méthanoliques de mastic vieillie thermiquement (à gauche) et vieillie naturellement pendant une centaine d’année (à droite)

VI.1.4 Enregistrement des spectres de fluorescence

Afin de séparer les fractions des différentes résines étudiées, nous avons sélectionné les constituants des résines présentant des pics d’absorption à 280 nm. Un choix de longueurs d’onde d’absorption plus faible nous aurait contraint à étudier la fluorescence de molécules ne présentant qu’une très faible fluorescence dans le visible. Néanmoins, comme l’illustre la figure 1bis, à partir de λabs= 220 nm, plus la longueur d’onde d’absorption est élevée, plus l’intensité des pics d’absorption diminue. Après le fractionnement des molécules présentant une absorption non négligeable, nous avons enregistréles spectres de fluorescence des différentes fractions à λexc = 320 nm afin d’observer un maximum du spectre de fluorescence suffisamment intense. Nous comparons ici les spectres de chaque fraction au moyen des deux critères λmax et Δλ établis au chapitre IV.

VI.1.5. Spectrométrie de masse

Parallèlement à la détection en absorbance UV, des mesures en spectrométrie de masse-électrospray ont été menées afin de tenter de connaître la nature chimique de chacun des composants de chaque fraction. Pour identifier un composé, il est nécessaire de connaître le rapport m/z de la masse molaire sur la charge de l’ion moléculaire qui permet de remonter à sa formule brute. Il faut ensuite affiner l’analyse à l’aide d’une mesure de lipophilie, pour déterminer l’arrangement des liaisons et ainsi remonter à la formule développée de la molécule. En effet, la technique d’électrospray, contrairement à une technique plus énergétique telle que par impact électronique, est une technique plus douce donc moins encline à fractionner les molécules. Ainsi, à notre stade de travail, l’obtention d’un rapport m/z permet de connaître les formules brutes des molécules contenues dans chaque fraction. Notre étude est une introduction à l’étude de la fluorescence des molécules constituantes des résines naturelles. La technique d’électrospray permet d’évaluer le type et la variété des molécules susceptibles de fluorescer. Une étude ultérieure en spectrométrie de masse en tandem ou en impact électronique pourra permettre l’identification de molécules présélectionnées au sein de la quantité présente au sein de la résine mastic.

La détection par spectrométrie de masse, reliée en série à la chromatographie liquide, a été réalisée avec un spectromètre de masse Q-tof Ultima API de la société Waters. Ainsi, le même gradient d’élution que dans le cas de l’utilisation du collecteur de fraction est utilisé.

VI.2 Influence du vieillissement sur la composition de la