La spectroscopie de fluorescence permet une discrimination aisée des échantillons de MOD (Kalbitz et al., 1999; Peuravuori et al., 2002a). Elle offre également une bonne sensibilité pouvant expliquer qu’elle ait été appliquée à l’origine à la MOD marine (Coble, 1996), dont les concentrations sont faibles. Cependant l’interprétation des spectres obtenus reste difficile pour identifier des fonctions puisque seuls 5 fluorophores caractéristiques sont actuellement « identifiés » dont 3 sont liés aux substances humiques (molécules difficilement identifiables) (Hudson et al., 2007). Ces bandes de fluorescence sont cités dans le Tableau 2 et désignées sur la Figure 3.
Nomenclature
ex (nm) em (nm) Type de fluorophores (Coble, 1996) (Parlanti et al., 2000) excitation émission
A α’ 230-260 380-480 Substances humiques C α 330-370 420-480 Substances humiques M β 310-320 380-420 Substances humiques marines B γ 225-250 300-320 Protéine type tyrosine T 225-275 320-380 Protéine type tryptophane
Tableau 2.Fluorophores majeurs de la MOD d’après (Coble, 1996); (Hudson et al., 2007); (Parlanti et al., 2002).
La bande de fluorescence notée α est observée à des couples de longueurs d’ondes comprises entre 330 et 370 nm en excitation et entre 420 et 480 nm en émission. Cette bande est attribuée aux substances humiques, acides humiques et acides fulviques confondus.
La bande α’ (Exc. 230-260/ Em. 380-480) est elle aussi attribuée aux substances humiques. Plusieurs études ont tenté d’attribuer cette bande à des composés plutôt de type fulviques (Mounier et al., 1999) en se basant sur son intensité relative plus importante dans des fractions de plus faibles poids moléculaires où les acides fulviques sont en proportion plus importante. Cependant il n’est pas possible d’être aussi catégorique puisqu’en fait, les bandes α et α’ sont systématiquement présentes
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ensembles sur tous les spectres d’échantillons d’eaux naturelles et également sur les spectres d’acides humiques ou d’acides fulviques (Vacher, 2004b). Ces deux fluorophores sont communs aux deux groupes, humiques et fulviques et leurs concentrations relatives (intensités des bandes α et α’) varient de façon indépendante en fonction de la nature et de l’origine de l’échantillon considéré (Vacher, 2004b).
La bande notée β a été attribuée à du matériel de type humique d’origine purement marine par (Coble, 1996) et a pu être observée dans le cas d’échantillons marins ou estuariens (Sierra et al., 1994) dans la zone du spectre allant de 310-320 nm en excitation et 380-420 nm en émission. Elle a également été isolée et observée dans une fraction chromatographique d’un échantillon d’eau côtière (Parlanti et al., 2002). Cette bande est rarement observée de façon très nette et il s’agit plus généralement d’un épaulement qui se détache du massif des substances humiques α. L’origine de ce type de fluorophore a plus précisément été reliée à une activité biologique et notamment à des exsudats algaux puisqu’elle a été observé au cours d’expériences de dégradation de phytoplancton et de macro algues (Parlanti et al., 2000). Cependant, le fait que ce fluorophore n’ait pas été mis en évidence dans les eaux douces continentales ne nous permet pas d’affirmer de façon catégorique son origine purement marine. En effet, l’importante intensité de fluorescence des substances humiques dans les échantillons peut totalement masquer le signal de la bande β ou d’autres fluorophores présents à de plus faibles concentrations.
La bande , associée aux protéines de type tyrosine, peut être observée pour des longueurs d’ondes comprises entre 225 et 250 nm en excitation et entre 300 et 320 nm en émission. La bande , associée aux protéines de type tryptophane, peut être observée pour des longueurs d’onde comprises entre 225 et 275 nm en excitation et entre 320 et 380 nm en émission. Ces bandes sont très proches l’une de l’autre et sont de fait parfois difficiles à discerner en raison de leur superposition. Compte tenu de la difficulté à différencier les signaux de fluorescence des types et , nous avons choisi de regrouper sous le terme de bande le signal de tous les composés de type protéiques qui fluorescent dans le domaine spectral compris entre les longueurs d’onde d’excitation 220 à 280 nm et d’émission 300 à 380 nm. Ces fluorophores ont une origine biologique algale ou bactérienne récente et correspondent à une fraction très labile de la MOD (Determann et al., 1998). Il a également été montré que la forte intensité de fluorescence des composés de types protéiques peut être utilisée comme marqueur de la MOD d’origine anthropique (rejets de stations d’épuration et effluents urbains) (Reynolds and Ahmad, 1997; Galapate et al., 1998; Baker et al., 2003; Reynolds, 2003; Baker and Spencer, 2004). De même, (Pernet-Coudrier, 2008) a démontré que les fractions issues des effluents de STEP présentent une forte intensité des pics attribués aux composés protéiques aromatiques de type tryptophane aux longueurs d’onde suivantes : Ex/Em : 220 nm/350 nm et Ex/Em : 280 nm/350 nm; et de type tyrosine Ex/Em : 220 nm/300 nm.
Figure 3. Spectre de fluorescence 3D d’un échantillon et sa projection dans le plan
Au-delà de la simple mesure de l’intensité des différentes bandes de fluorescence, certains s’intéressent aussi à étudier les rapports d’intensité I ’/I , Iβ/I et I /I (la bande est donc prise comme référence) (Vacher, 2004b). Cela permet de mettre en évidence la présence et l’évolution de toutes les bandes et ainsi d’observer les modifications du matériel organique dissous fluorescent. Par exemple, parmi ces rapports d’intensité, il y a le rapport I /I qui renseigne sur le caractère autochtone récent de la MOD puisque le fluorophore est attribué à des composés labiles, composés protéiques, mais distincts des composés de typeβ, tandis que est associé à des composés humiques donc plus matures.
Les gammes de valeurs obtenues pour le rapport I /I et les caractéristiques de la MOD associées à ces valeurs ont été regroupées dans le Tableau 3 (Vacher, 2004a).
Suivi par fluorescence des processus en milieu aquatique :
Outre l’observation et l’attribution des différentes bandes de fluorescence décrites ci-dessus, la spectrofluorimétrie permet d’étudier divers processus au travers des intensités relatives et des variations de position des maxima de ces bandes. Ainsi les travaux de (Parlanti et al., 2000) sur le suivi par fluorescence de la dégradation d’algues a permis de mettre en évidence la chronologie de formation des composés fluorescents et de montrer la possibilité d’utiliser la fluorescence pour estimer l’activité biologique au sein d’un milieu. Les résultats obtenus dans cette étude montrent que lors des premiers stades de dégradation ou d’exsudation, la bande apparaît en premier confirmant bien les
Indice de fluorescence
Ordre de grandeur Caractéristiques de la MOD
0,75 Caractère humique dominant 0,75-1,4
Composante autochtone : composés organiques labiles
Rapport I /I
1,4
Origine biologique ou bactérienne aquatique
Tableau 3. Origines et caractéristiques de la MOD associées aux gammes de valeurs obtenues pour le rapport I /I
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résultats de (Mayer et al., 1999) sur l’origine récente de ce type de matériel. La bande β apparaît ensuite et provient probablement des transformations des premiers composés formés, avant d’aboutir finalement à l’apparition de la bande de type décalée vers les plus grandes longueurs d’onde d’émission, c’est à dire de composés humiques qui représentent le stade ultime de dégradation de la MOD ayant subi de nombreuses transformations. L’évolution vers les plus grandes longueurs d’ondes d’émission (décalage vers le rouge) des maxima de fluorescence des substances humiques pour des longueurs d’onde d’excitation de 250 nm ( ’) et 370 nm ( ) semblent de plus indiquer une plus forte dégradation car cela a conduit à l’introduction d’un indice d’humification qui permet de rendre compte de la maturation de la MOD (Zsolnay et al., 1999).
I.6.3.3.2.