No intuito de se identificar transcritos referentes à peptídeos antimicrobianos no conjunto de dados do transcriptoma de Z. aethiopica, foram utilizados os padrões de peptídeos antimicrobianos ricos em cisteínas propostos Silverstein, Moskal et al. (2007). Foram utilizados scripts na linguagem Perl para se descrever as classes de proteínas transportadoras de lipídeos (LTP)/albuminas 2S/ECA 1, defensinas, heveínas, tioninas e snakinas/GASA/GAST como demonstrado na Tabela 3.
Tabela 3: Padrões de peptídeos ricos em cisteína.
Padrões AMP C.{6,15}C.{9,31}CC.{8,21}C.C.{13,35}C.{5,18}C LTP/Albumina 2S/ECA 1 C.{5,13}C.{14,20}CC.{8,10}C.{10,32}C LTP/Albumina 2S/ECA 1 C.{4,25}C.{2,12}C.{3,4}C.{3,17}C.{4,32}C.C.{1,6}C Defensina C.{2,14}C.{3,5}C.{3,16}C.{4,28}C.C Defensina C.{1,8}C.{4,5}CC.{5}C.{6}C.{3,5}C.{3,4}C Heveína C.{3}C.{3,4}C.{4,32}C.{2,3}C.{3,4}C Tionina CC.{10,11}C.{8,10}C.{5}C.{7,10}C Tionina C.{3}C.{3}C.{7,11}C.{3}C.{2}CC.{2}C.{11}C.{1,2}C GASA/GAST/Snakina
O script foi ajustado para selecionar as sequências contendo os padrões de peptídeos antimicrobianos, restringindo ao tamanho máximo de 350 resíduos de aminoácidos como descrito por Porto e colaboradores (2012). Os transcritos selecionados foram submetidos em seguida à análise do programa Phobius (KALL et al., 2007) para identificação de peptídeo sinal e regiões transmembrana. Subsequentemente as sequências com ausência de peptídeo sinal e as sequências com a presença de regiões transmembrane foram descartadas. As sequências restantes foram submetidas à análise do InterPro Scan (QUEVILLON et al., 2005) para identificação de domínios, onde o maior domínio assinalado foi escolhido como o domínio atual. Por conseguinte, sequências com caudas maiores que 30 resíduos de aminoácidos foram removidas. As sequências restantes fora submetidas ao programa CS- AMPPred (PORTO et al., 2010; PORTO et al., 2012) para predição de atividade antimicrobiana, onde as sequências preditas positivamente em dois ou três modelos CS- AMPPred foram selecionadas. O programa CS-AMPPred é uma maquina de vetor de suporte (support vector machine, SVM) desenhada especificamente para a predição de peptídeos antimicrobianos estabilizados por cisteínas. Adicionalmente, foi construído um alinhamento múltiplo utilizando-se ClustalW (THOMSON et al., 1994) a fim de se comparar as sequências preditas como antimicrobianas pelo CS-AMPPred.
3.3.1 Modelagem molecular dos AMPs identificados no transcriptoma de Z. aethiopica
O servidor LOMETS (WU e ZHANG, 2007) foi utilizado com o propósito de se encontrar o melhor modelo para modelagem comparativa. O servidor LOMETS consiste em um meta-threading server que coleta a informação de nove threading servers e classifica a informação relacionada aos modelos. O melhor modelo foi selecionado levando-se em consideração a cobertura e identidade dos alinhamentos. Desta forma, cem modelos tridimensionais teóricos foram construídos através do Modeller 9.10 (ESWAR et a., 2007). Os modelos foram construídos utilizando os métodos padrão de classificação automática de modelos. Os modelos finais foram selecionados de acordo com os DOPE scores (discrete optimized protein energy). Este score avalia a energia do modelo e indica a provável melhor estrutura. O modelo com o melhor DOPE score foi avaliado através ProSA II (WIEDERSTEIN e SIPPL, 2007) e PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1996). PROCHECK verifica a qualidade esteroquímica da estrutura da proteína através do gráfico de Ramachandran, onde os modelos confiáveis são esperados por apresentarem mais que 90% de seus resíduos de aminoácidos nas regiões mais favoráveis e permitidas, enquanto que ProSA II indica a qualidade do enovelamento. A visualização das estruturas foi realizada no programa PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.4.1, Schrödinger, LLC, http://www.pymol.org).
3.3.2 Alinhamento estrutural dos modelos selecionados e predição de ligantes
Os alinhamentos estruturais foram realizados em duas etapas, primeiramente através do servidor Dali (HOLM e ROSENSTROM, 2010), onde a avaliação dos alinhamentos estruturais foram realizados através do Z-score, um alinhamento estrutural com Z-score maior que 2 foi considerado significante. Adicionalmente, o servidor COFACTOR (ROY et al., 2012) foi utilizado como segundo método. COFACTOR utilizou o programa TM-align structure alignment (ZHANG e SKOLNICK, 2005) para realizar uma busca no Protein Data Bank (PDB) e então examinou os sítios ligantes, realizando a predição da posição dos ligantes em uma estrutura ou modelo, e construindo os complexos proteína-ligante. Desta maneira, esta abordagem permite a identificação da posição dos ligantes mesmo na ausência de experimentos de acoplamento normalmente conhecidos como estudo de interação molecular ou molecular docking.
3.3.3 Dinâmica molecular dos complexos peptídeo-ligante
As simulações de dinâmica molecular (DM) dos complexos proteína-ligante foram realizadas em ambiente de água, utilizando o modelo Single Point Charge water (BERENDSEN et al, 1981). As análises foram realizadas utilizando-se o GROMOS96 43A1 force field e o pacote computacional GROMACS 4 (HESS et al., 2008). A dinâmica conduzida utilizou os modelos tridimensionais dos complexos proteína-ligante como estruturas iniciais, imersas em moléculas de água em caixas cúbicas com uma distância mínima 0.7 nm entre os complexos e as fronteiras das caixas. Íons de cloro foram também inseridos dentro dos complexos com cargas positivas com o objetivo de neutralizar o sistema de cargas. A geometria das moléculas de água foi comprimida utilizando-se o algoritmo SETTLE (MYAMOTO e KOLLMAN, 1992). Todas as ligações atômicas foram realizadas utilizando-se o algoritmo LINCS (HESS et al., 1997). As correções eletrostáticas foram realizadas através do algoritmo Particle Mesh Ewald (DARDEN et al., 1993), com um cut off de raio de 1.4 nm a fim de se reduzir o tempo de trabalho computacional. O mesmo cut off de raio foi também utilizado para as interações de van der Waals. A lista de átomos vizinhos de cada um dos átomos foi renovada a cada 10 (dez) etapas de simulação de 2 (dois) fs. O gradiente conjugado e os algoritmos de descida mais íngreme (50,000 etapas cada) foram implementados para minimização de energia. Após isso, o sistema de temperatura foi normalizado para 300 K por 2 (dois) ns, utilizando-se o termostato de Berendsen (NVT ensamble). Adicionalmente o sistema de pressão foi normalizado a 1 (um) bar durante 2 ns, utilizando-se o barostato de Berendsen (NPT ensamble). Os sistemas com energia minimizada e temperatura e pressão balanceadas foram simulados por 50 ns através do algoritmo leap- frog. As simulações foram avaliadas através de valores de RMSD (Root-mean-square deviation) e DSSP (Define Secondary Structure of Proteins).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 PROSPECÇÃO DE TECIDOS FLORAIS COM PROPRIEDADES
ANTIMICROBIANAS
Inicialmente, foi realizado um processo de seleção envolvendo dez diferentes espécies de plantas (Tabela 4), com o objetivo de se avaliar as possíveis propriedades antimicrobianas nos tecidos florais. Ensaios antimicrobianos contra E. coli e S. aureus foram realizados com as frações ricas em proteínas de cada uma das dez espécies, utilizando-se uma concentração padrão de 200 µg mL-1 de cada amostra. Como pode ser observado na Tabela 4, de todas as amostras testadas, a espata de Z. aethiopica apresentou a maior atividade antimicrobiana contra o crescimento de E. coli, causando 96% de inibição do crescimento, entretanto não foi observado inibição do crescimento de S. aureus. Interessantemente, a espádice não apresentou atividade antimicrobiana contra nenhuma das bactérias testadas, como também foi observado para as amostras de rosa (Rosa sp.) e cravo (D. caryophyllus). Foram observadas atividades antimicrobianas para a amostra de vinca (C. roseus) de 50 % e 17 % contra E. coli e S. aureus respectivamente. A amostra de bouganvilea (B. glabra) apresentou apenas uma pequena inibição do crescimento de E. coli (4%). Finalmente, as atividades antimicrobianas de pata de vaca (B. variegata), espirradeira (N. oleander), margarida (Bellis sp.), lisiantus (Lisianthus sp.) e grevílea (G. banskii) não tiveram suas atividades confirmadas, uma vez que essas amostras tiveram a formação de um precipitado granular, o que prejudicou a medição dos ensaios através de absorbância de forma acurada.
A atividade antibacteriana dos tecidos de Z. aethiopica ainda não havia sido descrita. Contudo Lin et al. (2009) demonstraram atividade antifúngica de uma aglutinina de Z. aethiopica expressa em E. coli, que atua de forma semelhante às lectinas contra o mofo de folha Fulvia fulva; indicando o potencial antimicrobiano dessa planta.
Tabela 4: Avaliação do potencial antimicrobiano dos extratos florais contra E. coli (ATCC8739) e S. aureus (ATCC29213). Foram utilizados 200 g mL-1 de proteínas totais
para todos os tecidos testados. Foram utilizados 40 μg mL-1 de cloranfenicol como controle positivo de inibição do crescimento bacteriano, e água bidestilada estéril foi
utilizada como controle negativo.
Nome Popular Espécie Família Botânica Estrutura Inibição do Crescimento Bacteriano (%)
Escherichia coli (ATCC8739) Staphylococcus aureus (ATCC29213)
Vinca Catharanthus roseus Apocynaceae Pétalas 50,27 17,21
Pata de Vaca Bauhinia variegata Fabaceae Pétalas NC NC
Bouganvilea Bouganvillea glabra Nyctaginaceae Brácteas 4,30 0
Rosa Rosa sp. Rosaceae Pétalas 0 0
Espirradeira Nerium oleander Apocynaceae Pétalas NC NC
Margarida Bellis sp. Asteraceae Lígulas NC NC
Lisiantus Lisianthus sp. Gentianaceae Pétalas NC NC
Cravo Dianthus caryophyllus Caryophyllaceae Pétalas 0 0
Grevilea Grevillea banskii Proteaceae Inflorescência NC NC
Copo de Leite Zantedeschia aethiopica Araceae Espádice 0 0
Copo de Leite Zantedeschia aethiopica Araceae Espata 96,28 0
Ainda não estão reportados na literatura AMPs provenientes das espécies botânicas descritas na Tabela 4 com ação antimicrobiana confirmada, contudo, atividades antimicrobianas de compostos secundários têm sido descritas para as espécies de Rosa sp. (ANESINI e PEREZ, 1993; YI et al., 2007), D. caryophyllus (CURIR et al., 2003; MOHAMMED e AL-BAYATI, 2009), C. roseus (VERMA e SINGH, 2010; DHANKHAR et al., 2012), B. variegata (AHMED et al., 2012), N. oleander (BHUVANESHWARI et al., 2007), Bellis (AVATO et al., 1997) e Grevillea (SETZER et al., 2006), entretanto não foram relatados tecidos florais utilizados para esses testes antimicrobianos.
4.2 SEQUENCIAMENTO DE RNA DE NOVA GERAÇÃO (RNA-SEQ) E MONTAGEM