Directeur de Thèse : Pierre FEUGIER, PU-PH en Hématologie Clinique, CHRU de Nancy, Inserm U1256. Codirecteur de Thèse : Julien BROSÉUS, MCU-PH en Hématologie Biologique, CHRU de Nancy, Inserm
U1256.
Doctorante : Marion DIVOUX, Interne du DES d’Hématologie, CHRU de Brabois, Inserm U1256.
Ce projet de thèse comporte deux volets dédiés aux pathologies de la moelle osseuse (syndromes mixtes myélodysplasiques et myéloprolifératifs d’un coté, syndromes myélodysplasiques purs de l’autre), indépendants, mais s’appuyant sur les réseaux de recrutement hospitaliers (Nancy, Dijon), sur les plateformes techniques locales (Centre de Ressources Biologiques Lorrain, séquençage haut débit, méthylome sur puces Illumina) et sur les compétences de l’équipe en matière d’analyse bioinformatique.
Partie 1 : étude génomique des MDS/MPN-RS-T triples-négatifs (JAK2, MPL, et CALR non-muté). Introduction
Les syndromes mixtes myélodysplasiques/myéloprolifératifs avec sidéroblastes en couronne et thrombocytose ou « Myelodysplastic/Myeloproliferative Syndromes with Ring Sideroblasts and Thrombocytosis » (MDS/MPN-RS-T) sont des hémopathies malignes rares, appartenant à la famille des syndromes mixtes myéloprolifératifs/myélodysplasiques, qui présentent un profil moléculaire spécifique, associant une anomalie responsable du caractère myéloprolifératif (conduisant à un excès de cellules sanguines matures) et une anomalie responsable du caractère myélodysplasique (conduisant à des anomalies morphologiques de la lignée myéloïde et à une apoptose intra-médullaire des précurseurs).(3)
Le caractère myélodysplasique des MDS/MPN-RS-T peut être expliqué par des mutations affectant des gènes codant pour des acteurs de l’épissage alternatif, comme SF3B1 (85-90%), SRSF2 (7%), U2AF35 (4%) et ZRSR2 (3%), et/ou des mutations affectant des gènes codant pour des acteurs de la régulation épigénétique comme ASXL1 (15-29%), TET2 (10-25%), EZH2 (7%), DNMT3A (13-15%), SETBP1 (13%) et IDH2 (0-4%).(36, 37, 54, 55)
En revanche, les déterminants moléculaires du versant myéloprolifératif des MDS/MPN-RS-T ne sont pas totalement élucidés.
Le panorama mutationnel des syndromes myéloprolifératifs purs, chromosome Philadelphie négatifs, sont dominés par les mutations gain de fonction de l’exon 14 de JAK2 (Janus Kinase 2),(4) les mutations faux-sens situées dans l’exon 10 de MPL (Myeloproliferative Leukemia),(17) et les insertions/deletions décalant le cadre de lecture, situées dans l’exon 9 de CALR (Calreticuline) qui mènent à l’activation autocrine du récepteur à la Thrombopoïétine.(20, 21)
Mais dans le contexte des MDS/MPN-RS-T, les mutations de JAK2, MPL et CALR ne sont présentent respectivement que dans 42-57%, 1-3% et 0-1% des cas,(31, 41, 54, 55) ce qui signifie que près de 50% des ARS-T ne sont pas porteuses d’une mutation connue pour être responsable du caractère prolifératif.
Objectif
Notre but est d’identifier la ou les mutation(s) responsable(s) du caractère myéloprolifératif dans les MDS/MPN-RS-T triple négatifs.
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Avancée du projet
Durant un travail réalisé au cours du stage de Master II (année universitaire 2017-2018), les exomes de 6 cas index de MDS/MPN-RS-T triple négatifs ont été séquencés, ce qui a permis d’identifier 49 mutations candidates. Une partie de ces candidats ont été confirmés sur une grande cohorte de validation, en lien avec nos collègues Allemands du MLL (Munich Leukemia Laboratory). Actuellement, nous évaluons les conséquences fonctionnelles d’une surexpression de PTPN12, d’abord sur un modèle cellulaire HEK293 puis sur un modèle hématopoïétique type KG1a. Ce projet est mené en partenariat avec le Professeur François GIRODON (CHU de Dijon, Inserm U1231, Dijon) et dispose d’un financement.
Par ailleurs, nous souhaitons compléter l’étude de l’exome par une étude du méthylome par puce INFINIUM® Methylation EPIC 850K (Illumina, San Diego, CA, États-Unis d’Amérique).
Partie 2 : Étude méthylome/transcriptome des SMD avec excès de blastes traités par agents déméthylants. Introduction
Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont les hémopathies malignes myéloïdes les plus fréquentes dans les pays industrialisés. Elles touchent essentiellement les sujets de plus de 65 ans. Il s’agit d’un ensemble hétérogène de pathologies clonales de la cellule souche hématopoïétique, caractérisées par l’accumulation d’anomalies cytogénétiques responsables d’une apoptose intra-médullaire, de cytopénies sanguines (anémies, neutropénies, thrombopénies), d’anomalies morphologiques des cellules de la lignée myéloïde et dans certains cas d’un excès de cellules blastiques sanguines et/ou médullaires.(56) Les SMD avec excès de blastes font partie des SMD de haut risque, qui présentent un risque élevé d’évolution vers une leucémie aiguë myéloblastique secondaire, dont le pronostic est très réservé.
Sur le plan physiopathologique, les SMD relèvent d’anomalies épigénétiques en particulier de la dérégulation de la méthylation des gènes, en lien avec des mutations de TET2 et DNMT3a.(56, 57) Les SMD présentent des anomalies du profil de méthylation, avec une hypométhylation globale, mais une hyperméthylation des zones régulatrices de l’expression des gènes suppresseurs de tumeur, entrainant leur sous-expression.(58, 59)
Les stratégies thérapeutiques actuelles reposent sur l’utilisation d’agents « hypométhylants », la 5’-azacytidine (Azacytidine) notamment. Ces produits sont des analogues de la cytosine incorporés dans l’ADN durant la phase S. Leur action hypométhylante passe par une inhibition des DNA Methyl Transferases (DNMT). L’Azacytidine possède une double action, hypo-méthylante et cytotoxique, qui permet de restaurer l’hématopoïèse et d’obtenir une réponse dans 50% des cas. L’évaluation de l’efficacité de l’Azacytidine repose sur les critères cliniques et biologiques de l’International Working Group (IWG) : (i) la réponse clinique (indépendance transfusionnelle, amélioration de l’état général) et (ii) la réponse biologique (normalisation de l’hémogramme, du myélogramme et du caryotype médullaire).(60)
L’amélioration de ces paramètres peut toutefois être longue à apparaître et il n’existe pas de marqueur précoce de réponse. Dans plus de 85% des cas, ces critères ne sont pas évaluables avant au moins 6 mois, en raison d’une amélioration médullaire et sanguine tardive. Or environ 50% des patients sont finalement considérés comme non-répondeurs et seront restés sous traitement plusieurs mois, sans bénéfice final. En cas de progression de la maladie ou de non-réponse, le traitement est arrêté et la prise en charge devient palliative.
L’évaluation précoce de la réponse au traitement est au cœur des préoccupations actuelles. Les « Differentially Methylated Regions » (DMR), sont des régions de l’ADN dont le niveau de méthylation peut varier selon les patients. L’analyse des niveaux de méthylation de ces DMR peut révéler des profils corrélés à
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50 / 124 la réponse.(61, 62) L’étude concomitante du transcriptome permet d’identifier les DMR pertinents, dont la réversion du niveau de méthylation est associée à la réexpression de gènes déterminants dans l’efficacité thérapeutique, à savoir la reprise d’une hématopoïèse normale.
Objectifs
- Comparer, entre répondeurs et non-répondeurs à l’Azacytidine, les Differentially Methylated Regions (DMR) dont le niveau de méthylation a changé entre le diagnostic et la fin du 3ème cycle mensuel de traitement afin d’identifier précocement des profils de méthylation prédictifs de la réponse à l’Azacytidine.
- Identifier dès le diagnostic les profils des DMR prédictifs de la réponse à l’Azacytidine.
- Identifier les gènes dont le niveau d’expression est corrélé à ces profils de méthylation des DMR
Avancée du projet
Le projet s’appuie sur l’étude prospective MYRAGE (Myélodysplasies de haut Risque, étude Génétique et Épigénétique ; N° ClinicalTrials.gov : NCT03217903), portée par le CHRU de Nancy et incluant le recrutement de malades atteints de SMD avec excès de blastes, traités par Azacytidine et suivis pendant 12 mois. Un prélèvement médullaire est réalisé au diagnostic et après 3 mois de traitement pour extraction des ADN et des ARN puis étude du méthylome et du transcriptome.
Les accords administratifs (CPP, ANSM) ont été obtenus, de même qu’un financement pour l’analyse du méthylome des échantillons sur puce INFINIUM® Methylation EPIC 850K (Illumina) sur la plateforme de l’unité Inserm U1256 couplée à une étude du transcriptome par RNA-seq sur les mêmes échantillons.
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