V. Discussion
1. Les proies sentinelles : un proxy du processus de prédation efficace ?
A seguir são apresentados na forma de itens, os resultados referentes à avaliação clínica pós-operatória, acompanhamento radiográfico, mensuração da fosfatase alcalina sérica e avaliação histomorfométrica óssea de todos os grupos experimentais deste estudo.
5.1. Avaliação Clínica pós-operatória
Não houve qualquer complicação cirúrgica ou anestésica durante o procedimento de confecção da falha óssea do radio direito e esquerdo dos coelhos de todos os grupos experimentais. Mesmo após a confecção da falha óssea bilateral, todos os coelhos apresentaram pouca dificuldade de movimentação, sendo relativamente mais notória nos três primeiros dias do período pós-operatório, quando receberam a administração do cloridrato de tramadol.
Não houve complicação da ferida cirúrgica durante todo o período de avaliação pós-operatória. No entanto, notou-se o aumento de volume de consistência macia na região da ostectomia nos coelhos do grupo experimentais que receberam o implante de gel de quitosana ativado ou não (GIII, GIV, GV e GVI).
Dispensou-se a utilização de contenção química tanto para a terapia com ultrassom pulsado de baixa intensidade quanto para cuidados tópicos da ferida cirúrgica. Apenas para o procedimento radiográfico utilizou-se a acepromazina (0,5mg/kg, via intramuscular) a fim de evitar qualquer lesão iatrogênica durante a manipulação e posicionamento do animal.
Todos os animais mantiveram o comportamento, ingestão de água e ração em níveis normais. Não houve qualquer alteração clínica digna de nota.
5.2. Avaliação radiográfica
Por meio das imagens radiográficas do pós-operatório imediato confirmou-se a regularidade e padronização dos sítios de todas as ostectomias.
Como esperado, os locais da falha óssea apresentaram-se totalmente radioluscentes até mesmo aqueles que receberam o gel de quitosana ativado ou não com a rhBMP-2 (Figura 6). Com o tempo pôde-se observar o aumento da radiopacidade no local da falha ou em suas adjacências, decorrente do processo ativo de consolidação óssea.
Figura 6 - Imagem radiográfica do pós-operatório imediato demonstrando a
radioluscência no local da falha óssea, (A) rádio esquerdo do coelho 5 (GII), livre do gel de quitosana, e (B) rádio direito do coelho 14 (GIV) com falha óssea preenchida com gel de quitosana (setas).
No décimo quinto dia pós-operatório houve aumento da radiopacidade, compatível com crescimento ósseo, no local da falha óssea. Embora a amplitude do defeito ósseo ainda fosse grande, observou-se a presença de reação periosteal e início da formação de ponte óssea. Este fato foi observado em todos os grupos, porém, com menor intensidade nos coelhos dos grupos III e IV. Nos
coelhos destes grupos (GIII e GIV) também foi observado aumento de radiopacidade tipo tecido mole sobre o local da falha óssea, contudo, acredita-se que este seja decorrente do infiltrado inflamatório devido à presença do gel de quitosana. Os coelhos dos grupos V e VI receberam o gel de quitosana ativado com a proteína morfogenética óssea, e contrariamente ao observado nas radiografias dos coelhos dos grupos que receberam o gel de quitosana livre da proteína, não foi observado aumento da radiopacidade local decorrente da presença do gel (Figura 7).
Figura 7 -Imagem radiográfica do décimo quinto dia pós-operatório do defeito
ósseo em rádio de coelhos. Em A, a falha óssea foi preenchida com gel de quitosana não ativado; em B o gel introduzido na falha estava ativado com a rhBMP-2. Note a radiopacidade tipo tecido mole presente em A (setas) e ausente em B.
Considerando-se o trigésimo dia pós-operatório, foi observado aumento na radiopacidade local, com formação de ponte óssea em estágio mais avançado e redução da área de radioluscência da falha. Os melhores resultados radiográficos pertenciam aos grupos GI, GII, GV e GVI. A amplitude da área de radioluscência do defeito ósseo nas radiografias dos grupos GIII e GIV ainda eram maiores do que dos grupos restantes.
As radiografias do quadragésimo quinto dia pós-operatório revelaram que a formação de tecido ósseo novo no local da falha do rádio, foi melhor nos grupos
GI, GII, GV e GVI. Não houve o preenchimento completo de falha óssea no GIII, e apenas um no grupo GIV (coelho 16, rádio direito). A formação de ponte óssea, redução da linha radioluscente tornaram-se mais evidentes.
A Quadro 4 representa a avaliação radiológica comparativa dos grupos. Em seguida, as Figuras 8 a 13 apresentam as imagens radiográficas sequenciais representativas de cada grupo experimental.
Quadro 4 - Achados radiográficos nos diferentes grupos
experimentais nos dias 15, 30 e 45 do período pós- operatório.
REAÇÃO
PERIOSTEAL FORMAÇÃO PONTE ÓSSEA
15 dias GI + + 15 dias GII +/++ +/++ 15 dias GIII - - 15 dias GIV -/+ -/+ 15 dias GV + + 15 dias GVI ++ ++ 30 dias GI ++ ++ 30 dias GII ++ +++ 30 dias GIII + -/+ 30 dias GIV + -/+ 30 dias GV ++ +++ 30 dias GVI +++ +++ 45 dias GI ++ +++ 45 dias GII +++ +++ 45 dias GIII +/++ +/++ 45 dias GIV +/++ +/++ 45 dias GV +++ +++ 45 dias GVI +++ +++
(-) não observado, (+) observado com pouca intensidade, (++) observado com intensidade moderada e (+++) observado com intensidade elevada
GI - controle, GII – ultrassom, GIII-gel de quitosana, GIV - gel de quitosana e ultrassom, GV - gel de quitosana ativado com rhBMP-2 e GVI – gel de quitosana ativado com rhBMP-2 e ultrassom
Figura 8 - Imagem radiográfica do décimo quinto (A), trigésimo (B) e
quadragésimo quinto dia (C) pós-operatório de falha óssea em rádio de coelho do GI (controle). Projeções médio-laterais. As setas indicam a formação de ponte óssea, denotando preenchimento parcial do defeito ósseo. Embora seja possível observar ainda uma linha de radioluscência, o preenchimento da falha foi quase completo.
Figura 9 - Imagem radiográfica do décimo quinto (A), trigésimo (B) e quadragésimo
quinto dia (C) pós-operatório de falha óssea em rádio de coelho do GII (ultrassom). Projeções médio-laterais. Observe a formação de ponte óssea (seta) que preenche quase toda a falha logo no décimo quinto dia.
A B C
Figura 10 - Imagem radiográfica do décimo quinto (A), trigésimo (B) e quadragésimo quinto
dia (C) pós-operatório de falha óssea em rádio de coelho do GIII (gel de quitosana). Projeções médio-laterais. Note a reação periosteal (seta amarela) e pequena formação de ponte óssea (seta vermelha), denotando baixo preenchimento da falha óssea, até mesmo no último período de avaliação (45 dias).
Figura 11 - Imagem radiográfica do décimo quinto (A), trigésimo (B) e quadragésimo quinto
dia (C) pós-operatório de falha óssea em rádio de coelho do GIV (gel de quitosana e ultrassom). Projeções médio-laterais. Note a sutil reação periosteal no décimo quinto dia (seta amarela) com baixo preenchimento da falha óssea. Apenas no trigésimo dia foi possível observar a formação de ponte óssea (seta vermelha), ainda com baixo índice de preenchimento da falha.
A B C
Figura 12 - Imagem radiográfica do décimo quinto (A), trigésimo (B) e quadragésimo quinto dia
(C) pós-operatório de falha óssea em rádio de coelho do GV (gel de quitosana ativado com rhBMP-2). Projeções médio-laterais. É possível observar o início da formação da ponte óssea (seta vermelha) já nos primeiros quinze dias (A), com aumento do preenchimento no trigésimo dia e fechamento completo da falha no quadragésimo quinto dia (C).
Figura 13 - Imagem radiográfica do décimo quinto (A), trigésimo (B) e quadragésimo quinto
dia (C) pós-operatório de falha óssea em rádio de coelho do GVI (gel de quitosana ativado com rhBMP-2 e ultrassom). Projeções médio-laterais. Note o preenchimento quase completo da falha ósseo no décimo quinto dia (A) com formação de ponte óssea (seta vermelha) e reação periosteal (seta amarela) intensa. Na última avaliação radiográfica (C), observa-se o preenchimento completo do defeito ósseo.
A B C
Em algumas radiografias dos grupos que receberam o gel de quitosana, ativado ou não, foi possível visibilizar a formação de ponte óssea lateralizada. Desta forma, justifica-se a divergência de classificação do escore radiográfico da mesma falha em diferentes projeções (médio-lateral versus crânio-caudal).
A classificação do grau de preenchimento ósseo baseou-se no sistema de escala de Lane e Sandhu (1987), e é apresentada em forma de quadros de acordo com o grupo experimental (Quadro 4 à 15)
Quadro 5 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo controle (GI). – Projeção médio-lateral
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
MLD/MLE C1 0/0 3/3 4/4 -/- C2 0/0 2/3 3/3 -/- C3 0/0 0/0 3/2 3/2 C4 0/0 3/3 4/3 4/4 MLD, médio-lateral direito; e MLE, médio-lateral esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 6 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo controle (GI) – Projeção crânio-caudal
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
CrCaD/CrCaE C1 0/0 2/2 4/3 -/- C2 0/0 3/3 3/3 -/- C3 0/0 0/0 2/2 3/2 C4 0/0 2/3 4/4 4/3 CrCaD, crânio-caudal direito, CrCaE, crânio-caudal esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 7 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo ultrassom (GII). – Projeção médio-lateral
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
MLD/MLE C5 0/0 2/2 4/3 -/- C6 0/0 3/4 4/4 -/- C7 0/0 2/2 3/3 4/4 C8 0/0 3/3 3/3 4/4 MLD, médio-lateral direito; e MLE, médio-lateral esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 8 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo ultrassom (GII) – Projeção crânio-caudal
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
CrCaD/CrCaE
C5 0/0 2/2 4/4 -/- C6 0/0 3/3 4/4 -/- C7 0/0 3/2 3/4 4/4 C8 0/0 3/3 3/3 3/3 CrCaD, crânio-caudal direito, CrCaE, crânio-caudal esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 9 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana (GIII) – Projeção médio-lateral.
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
LD/LE
C9 0/0 0/0 1/1 -/- C10 0/0 1/0 1/0 -/- C11 0/0 0/1 1/1 3/2 C12 0/0 0/0 2/1 3/3 MLD, médio-lateral direito; e MLE, médio-lateral esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 10 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana (GIII) – Projeção crânio-caudal
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
CrCaD/CrCaE C9 0/0 0/0 2/2 -/- C10 0/0 1/0 1/0 -/- C11 0/0 0/1 2/3 3/3 C12 0/0 1/1 2/3 3/3 CrCaD, crânio-caudal direito, CrCaE, crânio-caudal esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 11 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana e ultrassom (GIV) – Projeção médio-lateral
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
MLD/MLE
C13 0/0 0/0 1/1 -/- C14 0/0 1/1 2/2 -/- C15 0/0 0/0 1/0 2/1 C16 0/0 1/0 3/2 4/3 MLD, médio-lateral direito; e MLE, médio-lateral esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 12 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana e ultrassom (GIV) – Projeção crânio-caudal
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
CrCaD/CrCaE C13 0/0 0/0 1/1 -/- C14 0/0 1/1 2/2 -/- C15 0/0 0/0 1/0 2/1 C16 0/0 0/0 3/2 4/3 CrCaD, crânio-caudal direito, CrCaE, crânio-caudal esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 13 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana e rhBMP-2 (GV).-Projeção médio-lateral
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
LD/LE C17 0/0 3/3 4/4 -/- C18 0/0 2/0 4/2 -/- C19 0/0 3/2 4/3 4/3 C20 0/0 0/1 1/1 3/3 MLD, médio-lateral direito; e MLE, médio-lateral esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 14 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana e rhBMP-2 (GV) – Projeção crânio-caudal
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
CrCaD/CrCaE C17 0/0 3/3 4/4 -/- C18 0/0 1/0 4/1 -/- C19 0/0 4/3 4/3 4/3 C20 0/0 0/1 1/1 3/3 Legenda: CrCaD, crânio-caudal direito, CrCaE, crânio-caudal esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 15 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo quitosana ativada com rhBMP-2 e ultrassom (GVI) –Projeção médio-lateral
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
MLD/MLE C21 0/0 1/2 3/3 -/- C22 0/0 4/4 4/4 -/- C23 0/0 1/2 4/2 4/3 C24 0/0 1/1 3/3 3/3 MLD, médio-lateral direito; e MLE, médio-lateral esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Quadro 16 - Classificação radiográfica relativa ao preenchimento da falha óssea segundo a escala
de Lane e Sandhu (1987) referente ao grupo controle (GVI) – Projeção crânio-caudal
COELHOS Pós-operatória 15 dias 30 dias 45 dias
CrCaD/CrCaE C21 0/0 1/2 3/3 -/- C22 0/0 1/1 4/4 -/- C23 0/0 2/1 3/3 4/3 C24 0/0 1/1 3/3 3/3 CrCaD, crânio-caudal direito, CrCaE, crânio-caudal esquerdo
(-): não aferido
(0) -Sem preenchimento da falha óssea, (1) – preenchimento de até 25% da falha óssea, (2) – preenchimento de até 50% da falha óssea, (3) – preenchimento de até 75% da falha óssea e (4) – falha óssea completamente preenchida (LANE e SANDHU, 1987)
Por meio do Teste de Tukey com nível de significância de 5%, foi observado que houve uma diferença estatística entre grupos, onde foi observada superioridade da média dos grupos GI, GII, GV e GVI sobre os grupos GIII e GIV.
Independentemente do grupo, a média do escore referente ao tempo de 45 dias (3,2083) foi superior à média do tempo 30 dias (2,6042); porém não houve diferença estatística entre estes períodos. Contudo os dados referentes ao tempo de 15 dias (média 1,4375) diferiram estatisticamente dos obtidos nos tempos 30 e 45 dias.
Embora se tenha notado diferença na classificação radiográfica individual frente aos diferentes posicionamentos, não houve diferença estatística entre os escores atribuídos para as radiografias em projeção médio-lateral e crânio-caudal do mesmo membro (direito ou esquerdo). Todavia, ao analisar comparativamente os dados referentes à classificação radiográfica de cada projeção de ambos os membros (direito e esquerdo), a média relativa à projeção médio-lateral direita diferiu estatisticamente das médias das outras projeções (médio-lateral esquerda, crânio-caudal direito, crânio-caudal esquerdo). Observou-se que as médias da classificação radiográfica de ambas as projeções do membro torácico direito foram superiores às médias obtidas para o membro esquerdo.
5.3 Mensuração da fosfatase alcalina (FA)
Em decorrência do processo ativo de consolidação óssea, foi constatado que a concentração sérica da fosfatase alcalina de cada coelho foi superior ao intervalo da normalidade que varia entre 4,1 e 16,2U/L (COLLINS, 1988). Contudo, o perfil cronológico crescente foi observado mais intensamente no grupo GVI, onde os coelhos receberam o gel de quitosana ativado bem como o tratamento com o ultrassom pulsado de baixa intensidade. Os grupos GI, GII e GV também apresentaram perfil crescente dos valores de FA, porém com valores médios inferiores aos do grupo GVI (figura 14).
Figura 14 - Valores médios da concentração da fosfatase alcalina sérica (U/L) de coelhos pertencentes aos grupos GI, GII, GIII, GIV, GV e GVI nos diferentes momentos (M0 à M6). O perfil crescente dos valores dessa enzima sérica foi observado nos grupos GI, GII, GV e GVI, este último apresentando as maiores médias a partir de M1. O perfil dos valores da FA sérica em GIII e GIV, embora variável, foi decrescente
Por meio do Teste de Tukey a 5% de probabilidade, verificou-se que apenas os valores obtidos Grupo VI apresentaram diferença estatística em relação aos outros grupos. A mesma análise estatística permitiu verificar que não houve diferença estatística dos valores de fosfatase alcalina sérica entre os diferentes momentos de colheita (M0 à M6). Os grupos que apresentaram as maiores médias e perfil de concentração crescente são aqueles que apresentaram as melhores taxas de preenchimento do defeito ósseo, sendo o contrário verdadeiro.
5.4. Avaliação Histológica
Foi possível observar a formação de osso novo em meio à área ostectomizada nas diversas lâminas de diferentes grupos, porém este processo de consolidação óssea apresentou algumas variações decorrentes dos diferentes tratamentos aos quais os coelhos foram submetidos. Os achados histológicos referentes a cada grupo experimental são apresentados na forma de itens, de acordo com o tempo (30 e 45 dias).
5.4.1 Trinta dias
Em relação às lâminas histológicas do rádio dos coelhos eutanaziados no trigésimo dia pós-operatório, foi observada a presença de um processo ativo de consolidação óssea endocondral, com presença de uma camada de fibroblastos, condrócitos hipertrofiados, osso imaturo e maduro. Considerando-se o local ostectomia, notou-se intensa população de células osteogênicas ativas no processo de consolidação óssea, tais como osteoblastos, osteócitos e osteoclastos. Nas amostras histológicas do grupo I, II e V, notou-se hiperplasia de tecido cartilaginoso, já nas amostras do grupo VI havia maior grau de maturação das lacunas e início de organização do osso lamelar.
Embora presente, a formação do calo e dos colares ósseos nas lâminas histológicas dos grupos III e IV parecia estar inibida frente ao grande infiltrado
inflamatório, composto por neutrófilos ativados, debris celulares, áreas de necrose e células fagocíticas que permeavam a falha óssea. Quando submetida à coloração de HE, a quitosana, que possui caráter acidofílico, adquiriu coloração vermelha intensa (Figura 15). Em todas as lâminas em que estava presente (todas do grupo III e IV, e algumas do grupo V) esta estrutura estava circundada por rico processo inflamatório compatível com reação granulomatosa de corpo estranho. Em meio a este processo inflamatório havia pouca formação de osso e, em algumas lâminas observou-se até mesmo preservação da regularidade das bordas do defeito ósseo. Neste último caso, houve crescimento ósseo apenas em porções ósseas periosteais proximais e/ou distais dos fragmentos ósseos, com pouca ou nenhuma evolução para o centro da área ostectomizada.
Figura 15 - Fotomicrografia da região de implante do gel
de quitosana no rádio de coelho, eutanasiado aos 30 dias de pós-operatório em que se constatam a presença de fibras de quitosana (ponta da seta vermelha), infiltrado inflamatório (estrelas amarelas), tecido fibrosos (triângulo azul) e osso mineralizado (losango verde). (Histosec, HE, 40X)
Como descrito no item Material e Métodos, os coelhos dos grupos V e VI receberam o gel ativado com a rhBMP-2 contudo, a quitosana caracterizada como uma estrutura vermelha descrita anteriormente foi encontrada apenas em algumas lâminas do grupo V, e em pequena quantidade no grupo VI (figura 16C e 16D). Nas lâminas
livres da presença das fibras de quitosana e do infiltrado inflamatório, observou-se melhor formação de osso novo havendo, em sua maioria, formação de ponte óssea e preenchimento parcial ou total da falha (figura 16A e 16B).
Em todos os cortes histológicos em que foi encontrada, a quitosana sempre se apresentou envolvida por infiltrado inflamatório, sem haver sinais de processo de consolidação óssea em áreas imediatamente adjacentes ao gel. No caso dos cortes histológicos do GV, a neoformação óssea não foi complicada pela presença do gel, sendo observada em apenas algumas lâminas. Quando presente notou-se organização deste processo inflamatório, circundado por tecido fibroso.
A Figura 16 apresenta os achados histológicos de cada grupo experimental dos coelhos eutanasiados aos trinta dias de pós-operatório.
Figura 16 - Fotomicrografia de cortes das áreas de falha ósseas induzidas
experimentalmente na diáfise do rádio de coelhos pertencentes ao GI (A), GII (B), GIII (C), GIV (D), GV (E) e GVI (F), eutanasiados aos trinta dias de pós-operatório. As imagens em que se observa maior quantidade de osso em meio à falha óssea são: A, B, E e F. Embora exista osso neoformado, é possível observar que o infiltrado inflamatório em C e D (triângulos amarelos) ocupam a maior área da falha. Em D nota-se que o infiltrado inflamatório é organizado, estando envolvido por tecido fibroso (losango azul). Em C, o infiltrado inflamatório que envolve o gel assume caráter não organizado (Histosec, HE, 10x).
A B
C D
5.4.2 Quarenta e cinco dias
Os achados nos cortes histológicos dos grupos experimentais no tempo de 45 dias foram semelhantes àqueles observados no tempo de 30 dias, porém, pode-se afirmar que a formação do osso novo e preenchimento da falha óssea foram maiores. Este fato foi mais evidente para os grupos GII e GVI, constituído em sua maior parte por osso maduro.
Tal formação do calo ósseo foi diminuta nos grupos que receberam o gel de quitosana não ativado (GIII e GIV), incluindo até mesmo aquele que recebeu a estimulação ultrassônica (GIV). A quitosana e o infiltrado inflamatório circundante também foram observados em alguns cortes histológicos do grupo GV que recebeu o gel ativado com a rhBMP-2, porém em pequena quantidade nas lâminas dos cortes que receberam o gel ativado associado a terapia com ultrassom (GVI).
Os achados histológicos da falha óssea dos coelhos eutanasiados aos 45 dias de pós-operatório são apresentados na Figura 17 e compreende todos os grupos experimentais deste estudo.
Figura 17 - Fotomicrografia de cortes das áreas de falha ósseas induzidas
experimentalmente na diáfise do rádio de coelhos pertencentes ao GI (A), GII (B), GIII (C), GIV (D), GV (E) e GVI (F), eutanasiados aos quarenta e cinco dias de pós-operatório. Observa-se que o preenchimento da falha óssea foi mais intenso em A, B, E e F. Em C e D ainda é possível observar a permanência do gel de quitosana envolvido pelo infiltrado inflamatório (triângulo amarelo) e por tecido fibroso (losango azul). Nota-se progresso maior do processo de consolidação óssea em E e F, onde se observa a organização do osso lamelar com menor número de espaços trabeculares.(Histosec, HE, 10x).
A B
C D
5.5 Avaliação Histomorfométrica
Embora a escolha do campo tenha sido ao acaso, consideraram-se apenas as áreas da falha óssea. Foram feitos quatro cortes de cada falha óssea, totalizando 192 cortes histológicos. Para obtenção dos valores referentes ao índice de osteoclastos, as contagens foram repetidas em oito campos diferentes de cada corte, totalizando 768 leituras. Para a mensuração do volume trabecular ósseo e da superfície osteoblástica, o procedimento foi repetido duas vezes em cada corte histológico, totalizando 384 leituras.
5.5.1. Índice de osteoclastos
Os valores referentes ao total de osteoclastos por campo foram analisados por meio de análise estatística (Teste de Tukey com probabilidade a 5%). Verificou-se que não houve diferença estatística entre os grupos nem mesmo entre os tempos (30 e 45 dias). A Tabela 1 apresenta os dados referentes a este parâmetro histomorfométrico do grupo e de cada período (30 e 45 dias).