PROCEDURE DIVISION IN THE INDEXED 1-0 MODULE

Na ausência da fração enriquecida em saponinas, todos os isolados foram capazes de produzir a enzima, sendo classificados como produtores moderados de hemolisinas. Os isolados de C. albicans apresentaram um IH médio de 0,51 ± 0,05, com destaque para os isolados LMMM 112, LMMM 196, LMMM 239 e LMMM 292 (IH < 0,48; Fig. 18).

Quando tratados com a fração enriquecida em saponinas, nenhum dos isolados foi capaz de produzir a enzima, apresentando um IH = 1,0 que é característico de inatividade enzimática. Evidenciou-se uma redução significativa na capacidade de produção de hemolisinas por parte desses isolados quando

tratados com a referida fração (Fig. 19). Entretanto, há um precipitado ao redor da colônia, que, apesar de claramente indicar não ser decorrente de hemólise, precisa ser melhor investigado.

Figura 18: Índice de hemólise (IH) dos isolados de Candida albicans e para a cepa de referência

ATCC 90028 de Candida albicans, na ausência (azul) e na presença (verde) da fração enriquecida em saponinas. O IH foi calculado dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia + o diâmetro da zona de hemólise, que foi induzida em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose. Cada barra representa a média ± DP da triplicata obtida para cada isolado. T = Desvio padrão. * Teste t de Student comparando-se os isolados tratados e não tratados correspondentes; p < 0,05.

Figura 19: A) Produção de beta hemólise (destruição total dos eritrócitos ao redor do crescimento

fúngico) por C. albicans ATCC 90028 em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose, na ausência da fração enriquecida em saponinas; B) Ausência de hemólise por parte de C.

albicans ATCC 90028 em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose, na presença da

fração enriquecida em saponinas, após incubação a 37 °C por 48 h em atmosfera com 5% de CO2. A determinação do IH foi realizada através da razão entre o diâmetro da colônia o diâmetro

da colônia + o diâmetro da zona de hemólise, de forma que quanto maior o IH menor a atividade hemolítica.

Com relação aos isolados de C. glabrata, na ausência da fração, todos foram capazes de produzir hemolisinas, entretanto, quando inoculados no meio contendo a fração enriquecida em saponinas, os mesmos isolados não foram capazes de realizar qualquer tipo de hemólise (Fig. 20).

Na ausência da fração enriquecida em saponinas, os isolados de C.

glabrata apresentaram um IH médio de 0,36 ± 0,06, caracterizando-os, quando

comparados com os isolados de C. albicans, como fortes produtores dessa enzima. Destaque para os isolados LMMM 453 e LMMM 708, fortes produtores de hemolisinas (IH < 0,33). Na presença da fração enriquecida em saponinas nenhum dos isolados de C. glabrata foi capaz de produzir a enzima, apresentando um IH médio de 1,0, mas também percebemos a presença de deposição de precipitado ao redor da colônia.

Figura 20: Índice de hemólise (IH) dos isolados de Candida glabrata e para a cepa de referência

ATCC 2001 de Candida albicans, na ausência (azul) e na presença (verde) da fração enriquecida em saponinas. O IH foi calculado dividindo-se o diâmetro da colônia pelo diâmetro da colônia + o diâmetro da zona de hemólise, que foi induzida em ASD suplementado com sangue de carneiro e glicose. Cada barra representa a média ± DP da triplicata obtida para cada isolado. T = Desvio padrão. * Teste t de Student comparando-se os isolados tratados e não tratados correspondentes; p < 0,05.

6 DISCUSSÃO

O presente trabalho tem como objetivo principal avaliar o perfil de susceptibilidade de isolados de Candida oriundos de infecções da corrente sanguínea (ICS) de pacientes atendidos em hospitais terciários na cidade de Natal – RN frente aos antifúngicos sintéticos empregados rotineiramente na terapia, bem como investigar a atividade antifúngica de uma fração enriquecida em saponinas do extrato de Z. joazeiro var. Martius e sua interferência direta na expressão de fatores de virulência in vitro associados a esse grupo de leveduras, incluindo: capacidade de adesão às células epiteliais bucais humanas, formação de biofilme, morfogênese e secreção de enzimas hidrolíticas (fosfolipases e hemolisinas).

Dos 70 isolados inicialmente avaliados neste estudo, 34,3% foram identificados como C. albicans, enquanto que os outros 65,7% dos isolados correspondiam a outras espécies de CNCA, incluindo: C. tropicalis (25,6%), complexo C. parapsilosis (25,6%), C. glabrata (10%), C. krusei (1,5%), C. ciferri (1,5%) e C. lusitaniae (1,5%), corroborando com o que vem sendo relatado na literatura, pois apesar de C. albicans permanecer como o agente mais isolado de diversos sítios, incluindo o sangue, outras espécies de Candida estão emergindo e causando infecções (SOBEL et al., 1998; HOSSAIN et al., 2003; GUINEA, 2014). Além disso é possível observar uma mudança epidemiológica no perfil da infecção quando se compara com estudos realizados em outras partes do globo. Em 2013, Nucci et al., realizaram um estudo que visava traçar o perfil epidemiológico da candidemia na América Latina, evidenciando um maior isolamento de C. albicans, seguido por C. parapsilosis e C. tropicalis, semelhante

ao perfil observado neste trabalho, reforçando a ideia que C. parapsilosis e C.

tropicalis despontam, após C. albicans, como as espécies mais prevalentes em

pacientes com quadro de candidemia.

No que diz respeito a susceptibilidade antifúngica, as leveduras do gênero

Candida tem demonstrado uma diminuição da susceptibilidade frente aos

antifúngicos sintéticos utilizados como primeira linha de tratamento, contribuindo para a ineficácia do tratamento dos indivíduos acometidos por infecções causadas por estes patógenos, além de gerar custos ao sistema de saúde (BEARDSLEY et al., 2018). Nenhum dos isolados avaliados apresentou resistência a Anfotericina B ou Micafungina, corroborando com os dados encontrados na literatura, uma vez que a menor resistência às equinocandinas está relacionado ao seu tempo de lançamento no mercado, que é ainda relativamente curto. A detecção da sensibilidade à Anfotericina B por microdiluição em caldo apresenta limitações, de forma que são recomendados testes adicionais para detecção de resistência, o que pode explicar, em parte, a sensibilidade dos isolados a este medicamento (BOFF et al., 2008; MAUBON et al., 2014).

O fenômeno de resistência foi evidenciado apenas para o Fluconazol, de forma que 7 isolados foram resistentes à esta droga, sendo 4 de C. albicans e os outros 3 eram isolados do complexo C. parapsilosis, C. glabrata e C. krusei enquanto que 11 isolados apresentaram uma SDD, sendo grande parte isolados de C. glabrata. Tal fato encontra-se de acordo com o que vem sendo descrito na literatura, uma vez que observa-se uma redução na sensibilidade de C. glabrata frente aos derivados azólicos, principalmente o Fluconazol, em decorrência da utilização desse medicamento como terapia profilática (BEARDSLEY et al., 2018).

Em um estudo de revisão realizado por Beardsley et al. (2018) foi demonstrado que C. glabrata está causando um índice crescente de infecções e para essa espécie vem sendo reportada uma taxa de resistência de cerca de 11- 13% aos derivados azólicos e de aproximadamente 13% para as equinocandinas, fator relevante, uma vez que às equinocandinas são a terapia de primeira linha para o tratamento de infecções causadas por leveduras do gênero Candida, além de serem utilizadas como profilaxia contra candidíase invasiva (BEARDSLEY et al., 2018).

Nenhum dos isolados apresentou resistência ao Itraconazol, entretanto foi observada uma diminuição na susceptibilidade dos isolados frente a esta droga. Este fato pode estar associado ao fenômeno de resistência cruzada entre os medicamentos incluídos na mesma classe e já vem sendo relatado para C.

glabrata (PFALLER et al., 2010; PFALLER, 2012; MCCARTY; PAPPAS, 2016).

O processo de resistência vem sendo descrito para algumas espécies de

Candida, sendo assim é extremamente importante a busca por novas alternativas

terapêuticas. A fração enriquecida em saponinas do extrato de Z. joazeiro, planta conhecida popularmente como Juazeiro, utilizada neste estudo, demonstrou atividade frente a isolados de C. albicans e C. glabrata, corroborando com os estudos realizados por Cruz et al. (2007) que observaram que o infuso da entrecasca de Z. joazeiro apresentou atividade contra C. albicans, C.

guilliermondii, Cryptococcus neoformans, Trichophyton rubrum e Fonsecaea pedrosoi. Em estudo realizado por Ribeiro et al. (2013), foram utilizadas as

saponinas extraídas da casca, evidenciando-se atividade contra C. albicans e

Os estudos realizados por Silva et al. (2011) e Melo et al. (2012), respectivamente, observaram que os extratos etanólico e hidroalcoólico da casca do Juazeiro apresentam atividade frente a C. albicans, pelo método de difusão em ágar. Reforça-se, assim, a potencial atividade da fração enriquecida em saponinas frente a isolados de C. albicans e C. glabrata, o que no cenário atual é de suma importância diante do quadro de multirresistência que C. glabrata vem apresentando, uma vez que esta é a segunda espécie mais isolada de quadros de candidemia, estando atrás apenas de C. albicans, em grande parte do globo, principalmente nos países desenvolvidos (MCCARTY; PAPPAS, 2016).

Foram descritos critérios alternativos por Fabry et al. (1998), que considera extratos com valores de CIM abaixo de 8.000 µg/mL com uma notável atividade antimicrobiana. Entretanto, outros autores sugerem que os produtos naturais são classificados como antimicrobianos quando são realizados testes de susceptibilidade, nos quais a concentração inibitória mínima se situe na faixa de 100 a 1000 µg/mL. A atividade de extratos brutos é considerada significativa se os valores de CIM são inferiores a 100 µg/mL, moderados quando 100 < MIC < 625 µg/mL ou baixa quando MIC > 625 µg/mL, o que não invalida os resultados obtidos nesse estudo, uma vez que Souza-Neto (2016), realizou o refinamento da fração enriquecida em saponinas e observou uma diminuição da CIM frente aos isolados de Candida testados (NGUTA et al., 2016).

No que diz respeito a expressão dos fatores de virulência, a capacidade das leveduras aderirem às células epiteliais bucais humanas foi reduzida quando os isolados foram tratados com a fração enriquecida em saponinas, tal fato pode estar associado à presença de saponinas nesta planta e, consequentemente, na fração utilizada, uma vez que estudos anteriores foram realizados e observou-se

que as substâncias responsáveis pela atividade antifúngica do Juazeiro eram as saponinas (CARVALHO, 2007; CRUZ et al., 2007). As saponinas apresentam a capacidade de formar complexos com os constituintes das membranas celulares, alterando dessa forma a permeabilidade celular, podendo levá-la à destruição (SCHENKEL et al., 2017). Por conseguinte, a incorporação de saponinas na parede celular fúngica, durante o crescimento em meio NGY poderia de alguma forma interferir na composição da parede celular, hipótese que precisa ser investigada de maneira mais aprofundada.

A redução na capacidade de aderência foi observada mais significativamente nos isolados de C. albicans, que caracterizam-se por apresentar uma elevada capacidade de adesão (KARKOWSKA-KULETA et al., 2009). Como a adesão é um evento inicial e crucial para o estabelecimento da infecção e manutenção do microrganismo, uma vez que o fenômeno de adesão esteja comprometido, a levedura encontrará dificuldades para realizar a colonização e iniciar o processo infeccioso no hospedeiro (FISHER et al., 2011; WANG et al., 2012).

O biofilme é uma das formas de crescimento mais prevalentes na natureza, sendo definido como uma comunidade microbiana embebida em uma matriz extracelular produzida pelos micro-organismos em superfícies bióticas e abióticas, estando a sua presença associada a uma diminuição na susceptibilidade dos isolados aos antifúngicos empregados no tratamento e uma redução na ação de células do sistema imunológico nas células de leveduras que contém os mesmos (KADRY et al., 2018).

Neste estudo, apenas os isolados de C. albicans foram capazes de produzir biofilme, enquanto os isolados de C. glabrata foram todos incapazes de

expressar esses fatores de virulência. Estes achados encontram-se de acordo com a literatura, uma vez que C. albicans caracteriza-se por ser a espécie do gênero com a maior capacidade de produção de biofilme (UDAYALAXMI et al., 2014). Dados da literatura acerca da formação de biofilme de outras espécies de

Candida, tais como espécies do complexo C. parapsilosis, C. krusei e C. glabrata

são muito variáveis, pois enquanto alguns autores relatam estas espécies como altamente produtoras de biofilme, outros as descrevem como baixos produtores de biofilmes (ESTIVILL et al., 2011; MELO et al., 2011; PANNANUSORN et al., 2013; DELALOYE; CALANDRA, 2014).

Apenas um único isolado foi classificado como forte produtor e outro como baixo produtor de biofilme, o que também encontra-se de acordo com a literatura, uma vez que muitos estudos afirmam que isolados dentro de uma mesma espécie de Candida podem ter níveis de capacidade de formação de biofilme diferentes ou simplesmente não produzir biofilme, o que explica a existência de isolados com “forte” ou “fraca” produção (JIN et al., 2003; THEIN et al., 2007; MELO et al., 2011; PANNANUSORN et al., 2013).

Os isolados de C. albicans tratados com a fração enriquecida em saponinas, apresentaram uma redução na capacidade de formação de biofilme nas duas condições testadas. Quando tratados com a fração antes da fase de adesão do biofilme, a redução foi mais significativa, cerca de 81%, do que quando tratados após a fase de adesão, redução de 50%. Tal fato pode estar associado a redução na capacidade de aderência que a fração causa, uma vez que as saponinas presentes na fração interagem com as membranas celulares e causam danos ao arcabouço celular, a adesão às superfícies encontra-se prejudicada,

dificultando o processo de formação do biofilme. Até onde se sabe, não existem estudos que utilizam o extrato e/ou frações do Ziziphus joazeiro que investigam a sua interferência na expressão dos fatores de virulência de Candida, o que traz ineditismo aos resultados obtidos.

Outro atributo de virulência explorado foi a morfogênese, tanto em meios líquidos quanto em meios sólidos. A morfogênese é um fenômeno reversível e observado em algumas espécies do gênero Candida que consiste na transição entre o estado leveduriforme e filamentoso, evidenciado a partir da formação de hifas verdadeiras e pseudo-hifas (CALDERONE; FONZI, 2001). O índice de morfologia observado no trabalho realizado mostrou que os isolados clínicos de

C. albicans quando não tratados com o referido produto vegetal apresentaram em

sua grande maioria, pseudo-hifas longas e hifas verdadeiras. Contrariamente, quando foram tratados com a fração, houve uma diminuição da transição levedura-hifa, de forma que a maioria das células de cada isolado apresentou-se, predominantemente, na forma de blastoconídios, ou de pseudo-hifas curtas, especificamente observado na presença de soro.

Quando semeadas em meio YPD sólido + 20% de SFB e incubadas à temperatura de 37°C durante 7 dias, apenas 8 isolados apresentaram-se filamentosos, de forma que esse meio não seria o mais indicado para observar a formação de hifas.

As colônias que apresentaram borda franjada, característico de colônias filamentosas, demonstraram mudança deste aspecto quando crescidas na presença da fração enriquecida em saponinas, onde as colônias adquiriram aspecto liso, indicativo de redução na capacidade de filamentação. No meio ágar Spider e no meio ágar NacGlc apenas 4 e 2 isolados não foram capazes de

filamentar, respectivamente, de forma que esses meios seriam os melhores para a observação da formação de hifas. Os isolados que apresentaram fenótipo de filamentação, quando tratados com a fração, também apresentaram colônias com bordas lisas, indicando novamente a interferência da fração enriquecida em saponinas no processo de morfogênese.

O processo de morfogênese é regulado através de duas vias, a via dependente de AMPc mediada pele Efg1 e uma via de MAPk que ativa o fator de transcrição Cph1, além de ser regulado por fatores ambientais (BORAL et al., 2018). Os dados apresentados neste estudo nos levam a supor a hipótese que, de alguma forma, um dano estrutural na superfície celular de C. albicans, causado pela fração enriquecida em saponinas pode ser responsável por inibição de vias que levam a morfogênese, o que foi observado quando os isolados de fenótipo filamentoso foram submetidos as condições de indução de filamentação em meios YPD+SFB 20%, Spider e NacGlc líquido e sólido.

Diversos estudos demonstram a importância da filamentação no processo de infecção por Candida, uma vez que as hifas são elementos importantes no processo de invasão tecidual, formação de biofilme e dano aos tecidos do hospedeiro, enquanto a forma leveduriforme associa-se mais aos processos de adesão e infecção (CALDERONE; FONZI, 2001; SILVA-ROCHA et al., 2015; BORAL et al., 2018). Sendo assim, se a fração enriquecida em saponinas interfere na ação deste importante fator de virulência, poderá apresentar potencial para uso futuro no tratamento da candidíase.

Outro fator de virulência importante na rota de infecção de Candida, é a secreção de enzimas hidrolíticas, dentre elas, as fosfolipases, que hidrolisam os fosfoglicerídeos (HUBE; NAGLIK, 2001). Os isolados na presença da fração

enriquecida em saponinas tiveram a secreção de fosfolipase inibida ou diminuída, fato verificado a partir da diminuição ou ausência da zona de precipitação nas colônias. Um estudo realizado por Khan et al. (2010) demonstrou que isolados clínicos em comparação com comensais apresentam uma maior capacidade de secretar esta enzima, estando tal fato associado à capacidade que a levedura apresenta de se disseminar e causar uma infecção, pois uma vez que ocorre a etapa de invasão, as leveduras precisam obter nutrientes e atravessar as barreiras do hospedeiro, alcançando tal fato a partir da secreção de tais enzimas (SILVA-ROCHA et al., 2015).

Em sua revisão Calderone e Fonzi (2001) relataram que as fosfolipases são importantes para a virulência em modelo animal de candidíase, uma vez que o mutante analisado produziu menos fosfolipase e, consequentemente, teve sua virulência reduzida quando comparado com o isolado selvagem. Desta forma, este fator de virulência aliado aos outros dois testados neste trabalho, são de grande importância para a ocorrência e manutenção da infecção no hospedeiro humano.

Com relação a atividade hemolítica, existem poucos estudos demonstrando a expressão deste fator de virulência nas diferentes espécies do gênero Candida. Entretanto, sabe-se que as leveduras utilizam essa enzima para degradar a hemoglobina e posteriormente adquirir o ferro contido no grupo heme, estando associado a manutenção e sobrevivência do patógeno no hospedeiro, uma vez que a aquisição de ferro promove o desenvolvimento de hifas e, por conseguinte, dá continuidade a rota de infecção (SILVA et al., 2012; ZUZA-ALVES et al., 2016; BORAL et al., 2018).

No presente estudo, todos os isolados foram capazes de produzir hemolisinas, com destaque para os isolados de C. glabrata que demonstraram forte atividade hemolítica, corroborando com os dados encontrados por Rossoni et al. (2013), cujos isolados de C. glabrata obtiveram um maior índice de hemólise quando comparados com os isolados de C. albicans. Mais uma vez, quando tratados com a fração enriquecida em saponinas, tanto os isolados de C. albicans quanto os isolados de C. glabrata não apresentaram qualquer atividade hemolítica. Tal achado é relevante, uma vez que as hemolisinas conhecidas por serem fatores de virulência que contribuem para a patogenicidade em espécies de Candida (SILVA et al., 2012). Entretanto, há um nítido precipitado escuro ao redor da colônia, que, apesar de claramente não representar hemólise, necessita ser investigado,

A regulação da atividade hemolítica de Candida é ainda pouco esclarecida, mas em um estudo realizado por Luo et al. (2001) foi visto que um gene da proteína hemolisina like (HLP) foi associado com a atividade hemolítica de C. glabrata. Dessa forma, pode-se hipotetizar que, de alguma forma, a fração enriquecida em saponinas poderia ser responsável pela inibição da expressão de genes associados a atividade hemolítica ou atuar através da lise da membrana eritrocitária.

7 CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho permitem as seguintes conclusões:

 Candida albicans foi a espécie mais prevalente entre os isolados de Candida spp. oriundos de hemoculturas analisados neste trabalho;

 Na triagem com antifúngicos sintéticos, grande parte dos isolados se demonstraram sensíveis às drogas utilizadas. Entretanto, alguns isolados de

C. albicans, C. parapsilosis e C. glabrata demonstraram resistência frente ao

Fluconazol ou susceptibilidade dose dependente;

 A fração enriquecida em saponinas obtida do extrato de Ziziphus joazeiro apresentou-se eficaz contra isolados de C. albicans e C. glabrata, atuando como fungicida na faixa de concentração 5000-10000 µg/mL;

 A fração enriquecida em saponinas interferiu na capacidade de adesão dos isolados de Candida spp., reduzindo a expressão in vitro deste fator de virulência;

 A capacidade de formar biofilme foi reduzida para algumas cepas quando tratadas com a fração enriquecida em saponinas, dentre elas um isolado de

Candida albicans altamente produtor de biofilme;

 A fração enriquecida em saponinas parece influenciar a expressão de outros fatores de virulência de Candida spp. in vitro, reduzindo a capacidade de formar hifas e secretar enzimas hidrolíticas (fosfolipases e hemolisinas);

 Mais estudos devem ser conduzidos a fim de se verificar o provável mecanismo de ação envolvido na atividade da referida fração.

8 REFERÊNCIAS

ALEXANDER, B. D.; JOHNSON, M. D.; PFEIFFER, C. D.; et al. Increasing echinocandin resistance in candida glabrata: Clinical failure correlates with presence of FKS mutations and elevated minimum inhibitory concentrations. Clinical Infectious Diseases, v. 56, n. 12, p. 1724–1732, 2013.

ALVES, S. H.; PIPOLO MILAN, E.; LAET SANT’ANA, P. DE; et al. Hypertonic sabouraud broth as a simple and powerful test for Candida dubliniensis screening. Diagnostic