Procédures chirurgicales

Le flux sanguin est mesuré au cours de la perfusion intracérébroventriculaire (icv) d’insuline (1mU.kg-1.min-1) ou des clamps hyperinsulinémiques comme décrit dans de précédents travaux (74, 229). Brièvement, un cathéter (Charles River Laboratories, Les Oncins, France) est placé dans le ventricule latéral des souris à l’aide d’un appareil stéréotaxique (-0,2 antéropostérieur, -1 latéral, -1,7 profondeur). Le cathéter est fixé sur le crâne par du cément dentaire. Dix jours après, un autre cathéter est placé dans la veine jugulaire droite ou la veine fémorale gauche des animaux; le restant du cathéter est introduit sous la peau pour être fixé au dos de l’animal avec une agrafe. Après trois jours de récupération, une sonde à ultrasons est instaurée autour de l’artère fémorale droite de la souris, et est fixée à demeure au muscle squelettique. Le reste du corps de la sonde est introduit sous la peau pour être fixé au dos de l’animal. Les chirurgies sont effectuées sous anesthésie générale avec un mélange gazeux oxygène-isoflurane. Les enregistrements des flux sanguins sont effectués trois jours après l’implantation de la sonde sur des souris à jeun depuis au moins 8h-10h (toute la nuit). Les animaux n’ayant pas récupéré ou ayant perdu du poids après chaque chirurgie sont écartés de l’expérimentation (~ 15% des animaux).

3-1-Perfusions et enregistrement des valeurs

Le jour de l’expérimentation, la sonde est reliée au débitmètre. L’animal est placée dans sa cage et peut se mouvoir librement. Le rythme cardiaque et le flux sanguin sont enregistrés pendant 30minutes avant de commencer les perfusions.

3-1-1-Perfusions intracérébroventriculaires

Insuline

Un bolus de 5µl d’insuline (1mU.kg-1.min-1, Actrapid 100U/ml ; NovoNordisk, Bagsvaerd, Danemark), suivi d’une perfusion continue à un débit de 12µl/h est réalisée avec du liquide cérébrospinal artificiel (aCSF) extemporanément fabriqué dans notre laboratoire et constitué de la composition ionique suivante : pH= 7,35, 144mmol/l Na+, 146mmol/l Cl-, 3mmol/l K+_{, 1mmol/l Mg}2+_{, 1,5mmol/l Ca}2+ _{et 1,2mmol/l PO4}-_{. D’après une étude antérieure}

- 147 - (229). Le groupe contrôle a reçu le véhicule dans les mêmes conditions expérimentales. Au total la perfusion cérébrale a duré 3h00.

Exendines

Les perfusions intracérébroventriculaires d’exendine-4 (agoniste) ou -9 (antagoniste) sont démarrées 30minutes avant de commencer le clamp puis, sont continuées jusqu’à la fin du clamp. Le débit de perfusion de l’agoniste ou antagoniste est de 0,5pmol/kg.min comme précédemment décrit (74). Le groupe contrôle reçoit le véhicule (aCSF).

NO et NG- monométhyl –L – arginine (L-NMMA)

Un donneur de NO à libération lente est perfusé lentement dans le ventricule latéral des souris durant 3 heures, seul ou en association avec l’insuline (SIN-1 ; Sigma, St Quentin Fallavier, France). Le SIN-1 est dissout extemporanément dans l’aCSF et, est ensuite perfusé à un débit de 4nmol/min comme précédemment décrit (259).

Le NG- monométhyl –L – arginine (L-NMMA), un inhibiteur non spécifique de NOS, est dissout de manière extemporanée dans l’aCSF et ensuite perfusé à un débit de 0,16µg/min comme précédemment décrit (251). Le LNMMA est lentement perfusé pendant 30minutes dans le ventricule cérébral des souris avant de commencer la perfusion d’insuline cérébrale durant 3heures en association au L-NMMA.

Peroxyde d’hydrogène (H202)

Le peroxyde d’hydrogène est perfusé dans le ventricule latéral des souris au début de la troisième heure du clamp hyperglycémique et hyperinsulinémique. Il est extemporanément dilué dans un tampon phosphate ou PBS (Phosphate Buffer Saline, pH=7,2) puis perfusé à un débit de 2,1 ou 21nmol/min (264). Brièvement, 2µl de H202 sont injectés dans le ventricule

latéral des animaux suivis d’une perfusion continue à un débit de 12µl/h. La perfusion a duré 1 heure.

3-1-2-Clamps

- 148 - GLP-1 cérébral (ou de son antagoniste) sur la vasomotricité périphérique et la sensibilité des tissus à l’action de l’insuline systémique selon les conditions d’équilibre glycémique (5,5mM ou 20mM). Les effets cérébraux du GLP-1 et de son antagoniste sont étudiés au cours des clamps euglycémiques et hyperglycémiques. Brièvement, l’insuline est perfusée à un débit constant de 18mU/kg.min (2µl/min) durant 3heures à travers le cathéter veineux fémoral. Chaque 10 minutes, le sang est prélevé à la queue de la souris et la glycémie est mesurée par un glucomètre. Elle est rapidement ajustée à 5,5mM ou 20mM à l’aide d’une perfusion de glucose qui se mélange avant l’arrivée dans le cathéter fémoral à la solution d’insuline grâce à un mélangeur. Le groupe contrôle est perfusé par du NaCl 0,9% durant 3 heures à un débit exactement identique à celui de la perfusion de glucose et d’insuline. La glycémie est aussi contrôlée au cours de cette perfusion.

A la fin des perfusions intracérébroventriculaires et/ou intraveineuses (figure-6), les souris sont euthanasiées par dislocation cervicale puis décapitées et le cerveau séparé du crâne en moins de 15 secondes pour être placé dans un moule (World Precision Instruments, Stevenage, U.K) refroidi à l’azote liquide. L’hypothalamus est rapidement prélevé et congelé à -80°C en moins d’une minute. La correcte implantation de la sonde à ultrasons est validée au cours des expérimentations par l’injection intraveineuse de nitroprussiate de sodium à des souris (10mg/kg, 25-40µl).

Figure-6- Souris portant un cathéter intracérébral et intrafémoral et une sonde à ultrasons de Transonic.

- 149 -

3-1-3-Injection intraveineuse de méthylatropine ou propranolol

Trente minutes après le commencement de la perfusion cérébrale d’insuline, la méthylatropine, un antagoniste des récepteurs muscariniques qui ne passe pas la barrière hématoencéphalique, ou le propranolol, un antagoniste des récepteurs β adrénergiques sont injectés dans la veine jugulaire droite. Un milligramme par kilo de poids d’animal est brièvement injectée sur 3minutes à la vitesse de 30µl/min (256).