1.1.1.1. Procédés d’extraction conventionnels

II.1.1.1.2 .

Procédés d’extraction innovants 43

II.1.2. Techniques d’extraction des composés peu volatils 50

II.1.2.1. Procédés d’extractios conventionnels 50

II.1.2.2. Procédés d’extraction innovants 51

II.1.3. Méthodes de dérivation en chromatographie en phase gazeuse (CPG) 53

II.1.3.1. Méthylation 54

II.1.3.2. Silylation 54

II.1.3.3. Méthanolyse acide suivie d’une réaction de silylation 55

II.1.4. Pyrolyse et dérivation « on line » 56

II.1.4.1. Principe 56

II.1.4.2. Dérivation « on line » pour Py-CPG-SM 57

II.2. Techniques physico-chimiques d’analyse des exsudats des plantes 58

II.2.1. Techniques spectroscopiques 58

II.2.1.1. Spectrométrie de masse directe 58

II.2.1.2. Spectroscopie du moyen et du proche infrarouge 59

II.2.1.3. Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire 62

II.2.2. Techniques chromatographiques 63

II.2.2.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) 63

II.2.2.2. Chromatographie en phase gazeuse (CPG) 64

II.2.2.3. Chromatographie en phase gazeuse bidimensionnelle (GCxGC) 67

II.2.2.4. Chromatographie en phase liquide (CPL) 71

Conclusion 73

Introduction

Les exsudats des végétaux sont des mélanges complexes. Cette complexité rend leur analyse chimique difficile. Aujourd’hui, l’évolution des technologies a permis la réalisation d’instruments très performants, apportant des possibilités nouvelles, notamment avec l’introduction des méthodes couplées et des méthodes non destructives. Ces méthodes se contentent de petits échantillons ne nécessitant pas, ou très peu de préparation préalable à la mesure. Cet avantage peut s’avérer être un inconvénient, lorsque le choix de la méthode, de la technique, et du procédé relatif à l’extraction et au prélèvement ne tient pas compte de la nature de l’échantillon à analyser. En effet, la composition chimique de ces substances ne dépend non seulement de l’origine botanique et géographique mais également du procédé d’extraction utilisé avant l’analyse. Pour tirer le maximum d’informations possibles (nature, composition et structure des composés présents) pour chaque type d’exsudat, plusieurs

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techniques analytiques ont été utilisées de façon complémentaire et rapportées dans la littérature. Les techniques spectroscopiques, le plus souvent simples à mettre en œuvre ont été utilisées pour obtenir les premières informations structurales, afin de déterminer le type d’exsudat concerné (gomme, résine, gomme-résine, latex…). Parmi ces techniques, les plus rapportées ont été la spectroscopie du moyen infrarouge (SMIR), la spectroscopie Raman et la spectroscopie par résonnance magnétique nucléaire (RMN) du solide [Lambert et al., 1985 ; Tchapla et al.,1999 ; Brody et al., 2001 ; Guiliano et al., 2007]. Par ailleurs, la spectrométrie de masse (SM) a été aussi utilisée en tant que technique d’analyse dans la caractérisation préliminaire de certains exsudats. La SM par désorption/ionisation de l’échantillon dans la source du spectromètre (après introduction directe) permet d’obtenir des spectres de masse intéressants, caractéristiques de la substance exsudée. Les travaux de Colombini & Modugno (2009) illustrent bien cela. Cependant, l’identification de leurs constituants moléculaires a été réalisée à partir des techniques séparatives couplées à la spectrométrie de masse, et particulièrement la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG-SM) [Méjanelle, 1996 ; Tchapla et al.,1999 ; Chiavari et al., 2002 ; Scalarone et al., 2003 ; Vo Duy, 2007 ; Regert et al., 2008 ; Doménech-Carbó et al., 2009 ; Lucero-Gómez et

al., 2013]. En outre, la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse

(CPL-SM) peut se montrer particulièrement utile et complémentaire, car elle permet de réaliser des analyses à température ambiante ou proche de celle-ci. De plus, la CPL-SM est adaptée à l’analyse des composés thermosensibles, et à la séparation des composés peu volatils et/ou polaires. La CPL-SM offre également la possibilité d’étudier la composition chimique des exsudats sans avoir à pratiquer de réactions de dérivation des composés non volatils. En revanche, l’identification des composés n’est pas aussi facile qu’en CPG-SM, car les banques de données spectrales commercialisées n’existent pas.

Nous traiterons dans ce deuxième chapitre, les différentes techniques de caractérisation des exsudats de plantes décrites dans la littérature. Cependant, avant toute analyse instrumentale, une étape de préparation de l’échantillon est nécessaire. Il apparait donc logique que la première partie, beaucoup plus exhaustive, porte sur les techniques de traitement d’échantillon. Cette étape représente à elle seule plus de 60 % du travail de l’analyste. Ces techniques de traitement d’échantillon englobent les techniques d’extraction et de dérivation. Les techniques d’extraction ont pour but l’élimination des interférents potentiels, la séparation des constituants d’intérêt de la matrice, et la concentration des analytes pour une meilleure

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détection. Les techniques d’extraction développées ici, concernent aussi bien les composés volatils que peu volatils. Elles ont été classées en deux catégories : les procédés conventionnels et ceux modifiés, surtout dans le but de réduire la consommation de solvants et d’énergie, qualifiés de procédés innovants. L’apport de chaque procédé et leur principe ont été brièvement

exposés. Par la suite, nous aborderons les méthodes de dérivations spécifiques à la CPG. Il s’agit essentiellement de la silylation, la méthylation et de la méthanolyse acide.

La deuxième partie, moins exhaustive, aborde les techniques d’analyses physico-chimiques. Il s’agit essentiellement des techniques spectroscopiques et chromatographiques. Les techniques spectroscopiques utilisées apportent les premières informations concernant la nature de l’exsudat et par conséquent, orientent le choix de la technique chromatographique et de leurs couplages. Les principales méthodes chromatographiques que nous exposons sont la CCM, la CPL-SM, la CPG-FID, la CPG-SM, et la GCxGC-MS.

II.1. Techniques de traitement d’échantillon

La première étape de l’analyse des exsudats consiste souvent à extraire les analytes de la matrice. En chromatographie en phase gazeuse, la deuxième étape qui intervient fréquemment est la transformation chimique des composés non volatils en dérivés volatils. Nous aborderons ici les différentes techniques d’extraction des composés volatils, peu volatils et les différentes techniques de dérivation utilisées en CPG dans la caractérisation chimique des exsudats des plantes.

Les techniques d’extraction visent à séparer de façon plus sélective et complète les substances présentes dans un mélange complexe. Le transfert de substances à analyser dans la phase d’extraction (gaz, liquide ou solide) va dépendre des propriétés chimiques des analytes :

la volatilité ;

la solubilité (hydrophobie) et la polarité; le poids moléculaire ;

le pKa.

Les analytes sont alors distribués entre deux phases non miscibles. Le partage des solutés est en effet un processus dynamique et peut être décrit en termes d’équilibre entre ces phases. Par contre, les techniques de dérivation en CPG modifient la structure chimique de ces composés, permettant ainsi l’obtention de dérivés plus volatils, moins polaires et beaucoup plus facilement séparables.

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II.1.1. Techniques d’extraction des composés volatils II.1.1.1. Procédés d’extraction des huiles essentielles

La norme AFNOR NF T 75-006 définit l’huile essentielle comme un produit obtenu à partir d’une matière première végétale, soit par entrainement à la vapeur, soit par des procédés mécaniques à partir de l’épicarpe de Citrus, soit par distillation sèche. Selon Bruneton (2002), cette définition est restrictive car elle exclut tous les produits obtenus par extraction à l’aide de solvant, que ceux obtenus par tout autre procédé. Les deux méthodes de distillation principalement utilisées sont donc l’entrainement à la vapeur et l’hydrodistillation.

II.1.1.1.1. Procédés d’extraction conventionnels

L’entrainement à la vapeur et l’hydrodistillation sont deux procédés conventionnels d’extraction des huiles essentielles. Ces deux techniques ont un même principe : la distillation hétéroazéotropique.

a) Entraînement à la vapeur d’eau

Il consiste à injecter de la vapeur d’eau fournie par une chaudière à travers la matière végétale située au-dessus d’une grille. Lors du passage de la vapeur à travers la matière végétale, les cellules éclatent et libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous l’action de la chaleur pour former un mélange « eau + huile essentielle ». Ce procédé a l’avantage de favoriser le traitement de matières végétales sensibles qui pourraient souffrir d’une longue ébullition.

b) Hydrodistillation

L’hydrodistillation, technique très ancienne, est la technique de référence dans l’étude des composés volatils des huiles essentielles. Le principe de cette technique est basé sur celui de la distillation des mélanges binaires [Bourquet et Augé, 2008]. L’échantillon à distiller se trouve en contact direct avec l’eau. Selon sa densité et sa quantité de matière, il peut flotter ou être complètement immergé. Ce mélange est ensuite porté à ébullition. La vapeur d’eau produite entraine les composés volatils. Après condensation par refroidissement, on obtient l’hydrolat qui est un mélange d’huile essentielle et d’eau. L’huile essentielle se sépare de l’eau par différence de densité. Par contre, lorsque les densités de ces deux phases sont très proches, il se forme une émulsion, l’huile essentielle est alors extraite par solvant. Plusieurs dispositifs d’extraction des huiles essentielles sont commercialisés. Le dispositif de type Clevenger (figure 2.1) est de loin le plus utilisé.

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Figure 2. 1. Dispositif de type Clevenger

L’hydrodistillation a été utilisée par plusieurs auteurs pour extraire les huiles essentielles des oléorésines, des gommes-résines et des gomme-oléorésines [Ramos et al., 2000 ; Siani et al., 2004 ; Koudou et al., 2005 ; Al-Harrasi and Al-Saidi, 2008]. Les techniques conventionnelles d’extraction des huiles essentielles présentent l’avantage d’être simples, efficaces et nécessitent un appareillage peu coûteux. Cependant, ces techniques posent des problèmes en matière de rendement, de durée d’extraction mais également quant à la préservation des molécules thermosensibles. Le contact avec l’eau, le chauffage et le pH du milieu peuvent entraîner des modifications chimiques (hydrolyse, déprotonation, hydratation, cyclisation et isomérisation). L’un des exemples illustrant ce fait est le cas du cis-hydrate de sabinène et de son acétate (figure 2.2). L’autre inconvénient de cette technique est la perte en huile essentielle due à la condensation dans le réfrigérant.

OR

H

-H

O

+

+ ^-H

H

O

OH

hydrate de sabinène: R=OH

cation terpin-1-èn-4-yl

terpinolène

terpin-1-èn-4-ol

-H

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