Lors de ma maitrise, j’ai démontré qu’il était possible de générer des protéines de fusion ligands des deux principales classes de GPCRs (Charest-Morin et al., 2013; Charest-Morin et Marceau, 2016). J’ai créé des protéines de fusion ligands des récepteurs PTH1 et B2. En
effet j’ai généré une protéine de fusion fluorescente agoniste du B2R. Celle-ci est composée
de la GFP fusionnée à l’extrémité N-terminale de la maximakinine (MK; EGFP-MK). Par la stimulation de cellules exprimant transitoirement le B2R de lapin avec EGFP-MK, j’ai
démontré que cette protéine de fusion est internalisée par un mécanisme β-arrestine dépendant. Une protéine de fusion pour le PTH1R a aussi été conçue. Puisque dans le cas
du PTH1R, c’est l’extrémité N-terminale qui interagit avec le récepteur (Pal et al., 2012), la
GFP a été fusionnée à l’extrémité C-terminale de la PTH1-34 (PTH1-34-EGFP; Charest-Morin
et al., 2013). Cette construction a permis de visualiser l’endocytose du PTH1R ainsi que sa
colocalisation avec les β-arrestines ainsi qu’avec plusieurs marqueurs des endosomes précoces et tardifs. C’est sur ces travaux antérieurs que se basent mes travaux de doctorats. Pour mon doctorat, j’ai décidé de poursuivre mes travaux sur les protéines de fusion ligands des GPCRs. Toutefois, j’ai développé ces protéines de fusion afin de leur conférer des propriétés non seulement d’imagerie mais aussi des propriétés diagnostiques et thérapeutiques. Dans mes travaux de doctorat, j’ai utilisé mes connaissances sur les
protéines de fusion pour répondre à deux problématiques, la première avec des applications diagnostiques alors que la seconde a des applications thérapeutiques.
La première problématique que j’ai étudiée est la difficulté de détecter les niveaux endogènes de GPCRs. En effet, ce sont des protéines très difficiles à détecter avec les stratégies actuelles, notamment les anticorps. Il y a plusieurs situations où il est impossible de générer des anticorps contre certains antigènes. Par exemple, lorsque l’antigène possède une forte homologie avec une protéine de l’animal immunisé, il sera très difficile de générer un bon anticorps (Chames et al., 2013). C’est un problème pertinent dans le cas des GPCRs, car ces récepteurs sont souvent bien conservés d'une espèce à l'autre. Aussi si l’épitope à reconnaitre est conformationel ou post-traductionnel, l’anticorps résultant risque d’être éliminé lors de l’apprêtement des antigènes (Keefe et al., 2013). Pour détecter des GPCRs sur de cellules intactes, il faut absolument que l’anticorps soit capable de reconnaitre la conformation intacte et tridimensionnelle du récepteur alors que la plupart des anticorps sur le marché reconnaissent les structures dénaturées des protéines. Aussi il est très difficile pour des molécules de très grandes tailles comme les anticorps (>150 kDa) de détecter les GPCRs intacts, car ceux-ci sont enfouis dans la membrane plasmique. De plus, comme mentionné plus haut, les anticorps anti-GPCRs commerciaux ne sont pas validés et sont plus souvent qu’autrement non-spécifiques (Michel et al., 2009). Une autre étude portant sur plus de 20 000 anticorps commerciaux a rapporté que seulement la moitié d’entre eux pouvait détecter leur cible dans l’application recommandée par le fabricant (Berglund et al., 2008). Une approche basée sur les protéines de fusion permettrait la détection spécifique des GPCRs. En effet, cette approche est basée sur le peptide ligand du récepteur qui bénéficie de plusieurs millions d’années de coévolution avec sa cible, résultant en une affinité très élevée. Toutefois, l’approche basée sur les protéines de fusion fluorescentes que j’ai explorée durant ma maîtrise n’est pas compatible avec la détection des populations endogènes de récepteur. En effet, ceux-ci sont trop peu abondants, seulement quelques fentomoles de récepteurs par cm2 de cellules en culture. Aussi, la
fluorescence n’est pas un outil assez sensible pour permettre la détection de ces récepteurs. Je m’étais donc fixé comme objectif de développer des protéines de fusion ligands des deux principales classes de GPCRs (A et B) permettant la détection des niveaux endogènes de ces récepteurs. Pour y arriver, j’ai proposé de remplacer le domaine fluorescent de mes
précédentes constructions par des domaines fonctionnels (enzymes ou domaine antigénique). Cela devrait permettre une amplification du signal émis par la protéine de fusion ce qui supportera la détection de faible quantité de GPCRs.
La seconde problématique de recherche couverte par mon projet de doctorat concerne la stimulation du B2R. Des données précliniques suggèrent que la stimulation du B2R par son
agoniste, la BK, cause de nombreux effets cardiovasculaires bénéfiques. En effet, l’administration de la BK entraine des effets anti-hypertensifs et des effets cardioprotecteurs (anti-hypertrophie, prévention des infarctus et prévention des arythmies; Blaes et Girolami, 2013). De plus, les effets thérapeutiques des inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine proviennent en partie de la stimulation du B2R par la BK
(Linz et al., 1995). Malgré l’ensemble de ces effets bénéfiques, ni la BK ni aucun agoniste du B2R n’est utilisé en clinique. La raison est simple; la BK cause de nombreux effets
extravasculaires indésirables. La BK peut stimuler directement les afférences sensorielles nerveuses menant ainsi à la perception de douleur (Golias et al., 2007). Toujours dans le système nerveux, la BK peut aussi stimuler la partie afférente du système nerveux autonome et causer ainsi de la tachycardie (Cloutier et al., 2002). Puisqu’il semblerait que la majorité des effets bénéfiques de la BK soient générés par une stimulation endothéliale et que les effets néfastes par une stimulation extravasculaire, j’avais comme objectif d’essayer trouver une solution pour dissocier les effets bénéfiques des effets néfastes. J’ai donc proposé qu’un ligand de haut poids moléculaire puisse permettre la stimulation vasculaire des récepteurs B2 de la BK sans stimuler les récepteurs extravasculaires. En effet, un ligand
de haut poids moléculaire du B2R serait restreint au niveau vasculaire, car son haut poids
moléculaire l’empêcherait de sortir de la circulation. Pour ce faire, j’ai fusionné une protéine de haut poids moléculaire à l’extrémité N-terminale de la BK et j’ai évalué l’activité pharmacologique d’une telle construction.
En combinant les connaissances sur les protéines de fusion ainsi que sur les GPCRs, il sera possible d’étudier de manière plus approfondie ces récepteurs et d’ainsi générer des protéines de fusion conférant des nouvelles propriétés thérapeutiques ou diagnostiques aux ligands de ces récepteurs
MATÉRIEL ET MÉTHODES