1 – Principes et méthodes comptables (annexe)

3.1.Tipo de estudo

Estudo transversal observacional analítico com indivíduos portadores de câncer colorretal e indivíduos saudáveis.

3.2.População e local de estudo

Pacientes portadores de cancer colorretal encaminhados ao ambulatório de Coloproctologia e Câncer de Reto do Gastrocentro/FCM/UNICAMP e indivíduos controle assintomáticos submetidos a rastreamento de cancer colorretal.

3.2.1. Critérios de inclusão ao grupo controle

Pacientes maiores de 18 anos, que tenham indicação de colonoscopia preventiva, cujo exame encontra-se dentro da normalidade ou com diagnostico de adenomas sem displasia de alto grau.

3.2.2. Critérios de inclusão ao grupo pacientes

- Portador de câncer colorretal diagnosticado por exame histopatológico. - Apresentar capacidade de entender os procedimentos do estudo, e concordar em participar do mesmo de forma voluntária por meio do termo de consentimento informado.

3.2.3. Critérios de exclusão - Antecedente de colectomia.

- Indivíduos sem indicação de colonoscopia. - Portadores de derivações intestinais.

- Pacientes portadores de PAAF (polipose adenomatosa familiar), doença inflamatória intestinal, hepatopatia grave,

- Portadores de cancer colorretal com quimioterapia ou radioterapia neoadjuvante.

3.3.Cálculo do tamanho da amostra

Variável principal: proteobacterias (contribuição relativa %)

Foi utilizado cálculo amostral para a diferença de média entre os 2 grupos independentes fixando α em 5% e β em 5% (poder 95%). Foram necessários em

cada grupo 26 sujeitos. Os cálculos foram realizados pelo software G*Power versão 3.1.2, 1992-2009, [101].

3.4.Análise estatística

As variáveis quantitativas com distribuição normal foram analisadas quanto à sua média e quanto ao seu padrão de distribuição e o teste t de Student foi usado para a comparação de duas amostras independentes, e para aquelas com distribuições não-normais, mediana (intervalo interquartil [IQ]) foram apresentados e o teste U de Mann-Whitney foi usado para a comparação de duas amostras independentes.

As variáveis qualitativas foram apresentadas em percentagem, e o teste Qui- quadrado foi utilizado para a comparação de duas proporções (de amostras independentes). O teste exato de Fisher foi usado para um pequeno número de frequências esperadas (quando o número total de casos for menor que 20), para as quais o teste Qui-quadrado não foi apropriado.

Para análise de correlação entre as variáveis dicotômicas utilizou-se os testes de correlação de Pearson e Spearman. Os testes de Pearson e Spearman geram coeficientes que variam de -1 a 1 e os valores próximos às arestas sinalizam correlações negativas ou positivas, respectivamente.

O programa utilizado foi SPSS 25.0 – Advanced Statistics para elaboração do banco de dados, análise estatística e edição de gráficos. O nível de significância adotado para os testes estatísticos foi de 5% (P<0,05 será considerado estatisticamente significativo).

3.5.Aspectos éticos

O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da FCM- Unicamp. O parecer de número 885749/14 foi referente a coleta dos dados do grupo controle e o parecer de número 2.144.670/17, refere-se a coleta de dados dos pacientes com câncer colorretal.

3.6.Avaliação clínica

Foram selecionados os indivíduos portadores com câncer colorretal, e encaminhados ao serviço de Coloproctologia da UNICAMP com a suspeita clínica (emagrecimento, sangramento ao evacuar, alteração do hábito intestinal, exames suspeitos). O diagnóstico e estadiamento foram feitos com colonoscopia, tomografia de abdome, pelve e tórax e ressonância de pelve quando houvesse indicação.

O protocolo de avaliação clínica e dados relacionados aos indivíduos, encontram-se no anexo I.

As amostras de fezes e biópsia foram armazenadas em freezer -80C até o momento da análise da extração do DNA bacteriano.

3.7.Colonoscopia

O preparo intestinal para colonoscopia foi realizado por meio de dieta líquida e ingestão de 500 ml de manitol a 10%, diluídos em 1000 ml na véspera do exame. Foram realizadas cinco biópsias no colón transverso, cinco biópsias em reto (em ambos os grupos) e cinco biópsias do tumor (no grupo pacientes). O material foi colocado em tubos rnase de dnase free e direto nitrogênio líquido (N2 líquido). Depois foi armazenado em freezer -80oC. Para extração de DNA usou-se o Kit DNeasy Blood & Tissue Kit e para RNA o trizol seguido de purificação com RNeasy Mini Kit. Este material encontra-se armazenado para pesquisas futuras.

3.8.Amostra fecal

As amostras fecais foram coletadas sem o uso de qualquer laxativo e armazenadas em tubo coletor com conservador de DNA bacteriano (PSP® Spin Stool DNA Plus Kit)

3.9.Análise da microbiota por sequenciamento do RNAr 16S

O DNA total da microbiota intestinal foi extraído com o kit de DNA Plus Stool PSP Spin (STRATEC Biomedical AG, Alemanha), um sistema integrado para coleta, transporte e armazenamento de amostras de fezes e posterior purificação de DNA.

3.9.2. Preparo das bibliotecas

Para o preparo das bibliotecas foram necessários 12,5ng de DNA, 5mM de primers (ou iniciadores) específicos para a amplificação da região altamente conservada (V3 e V4) (quadro 1) do gene 16S bacteriano e 12,5uL do pré-mix 2x KAPA HIFI hotStart (KAPABIOSYSTEMS – EUA)

Quadro 1. Sequência de primers para região V3/V4 do gene 16S

Região Sequência 5´ - 3´ V3 - 341 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG V4 - 785 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC

A sequência em itálico corresponde ao adaptador Nextera® transposase sequences A e B e a sequência em negrito correspondem aos iniciadores de ampla utilização 341F e 785F respectivamente (Illumina, San Diego, CA, USA). Posteriormente foram utilizadas para o preparo das bibliotecas com o kit Illumina Miseq DNA Sample Preparation v3 com código de barra para cada amostra. O sequenciamento foi realizado no equipamento Illumina Miseq do Laboratório de Genética Molecular coordenado pela profa. Dra. Íscia Lopes-Cendesda FCM- Unicamp

A composição taxonômica das comunidades bacterianas foi obtida pela análise da região V3 E V4 do gene 16S rRNA usando a plataforma Illumina® MiSeq. As construções das bibliotecas de sequenciamento do DNA foram realizadas segundo instruções do fabricante (Illumina, San Diego, CA, USA) e seguiram o mesmo fluxo descrito por Caporaso et al, 2012[102]. Usando leituras pareadas de 300 bp e reagentes MiSeq v3, as extremidades de cada leitura são sobrepostas para gerar leituras completas de alta qualidade da região V3 e V4. São geradas mais que 100.000 leituras por amostra, comumente reconhecidas como suficientes para pesquisas metagenômicas. As sequências fastq foram anlisadas analisados utilizando-se o software Illumina 16S Metagenomics. Para a analise de alpha e beta diversidade foi utilizado o softwre MicrobiomeAnalyst - Marker Data Profiling (MDP) [103, 104] que executa a classificação taxonômica da região v3/v4 do gene 16S rRNA por meio do banco de dados Silva. A análise dos gêneros da microbiota intestinal foi feita pelo software Galaxy, LDA-LEfSe o qual é um algoritmo para identificação de biomarcadores de alta dimensão, que caracteriza diferenças entre as condições biológicas. O programa LEfSe fornece uma lista de diferentes táxons entre o grupo controle e grupo de paciente com significância estatística e biológica, classificando-os de acordo com o tamanho do efeito. Os táxons em abundância do grupo controle (verde) ou pacientes (vermelho) recebem uma classificação LDA positiva ou negativa, respectivamente (taxa com classificação LDA> 2 e significância de <0,05 determinada pelo teste de Wilcoxon). A análise discriminante linear (LDA) pelo tamanho do efeito (LEfSe) foi utilizado para identificar táxons que discriminaram os perfis de microbiota de acordo com cada grupo Controle ou Paciente.