Principe de préconcentration

2. 1 En électrophorèse capillaire

de séparation. Les approches développées peuvent être classées en deux catégories en fonction des phénomènes physiques intervenant dans la préconcentration des analytes. La première catégorie est basée sur les différences de mobilités électrophorétiques des solutés dans certaines conditions et comprend les techniques dites de stacking par amplification de champ, de stacking par jonction de pH dynamique, d’isotachophorèse. Ces techniques sont bien adaptées à la préconcentration de composés chargés mais ne sont pas applicables aux composés neutres puisqu’ils n’ont pas de mobilité électrophorétique. La deuxième catégorie fait intervenir des différences de distribution des analytes entre une pseudo-phase ou phase stationnaire et l’électrolyte et comprend les techniques de préconcentration de type chromatographique dont le sweeping. Ces techniques sont utilisables pour des composés neutres et chargés.

● Les méthodes de préconcentration par amplification de champ reposent sur la différence de champ électrique local de part et d’autre de la frontière entre la zone de l’échantillon et la zone d’électrolyte de séparation. En effet, lorsqu’un soluté est dissous dans un milieu échantillon dont la conductivité électrique est moindre par rapport à celle de l’électrolyte de séparation, alors un phénomène de concentration intervient lors de l’application de la tension. Dans ces conditions, le champ électrique présent au niveau de la zone de migration de l’échantillon est plus important que celui existant dans l’électrolyte de séparation. Les ions migrent alors très rapidement jusqu’à l’interface entre les zones de faible et de forte conductivité puis ralentissent dès qu’ils atteignent la frontière entre ces deux zones, créant ainsi leur accumulation dans une zone de plus faible largeur. Les diverses techniques de stacking présentent des variations de mises en œuvre et jouent sur les phénomènes de migration des ions à partir du principe décrit. [1]. Des facteurs de préconcentration de plusieurs dizaines à plusieurs milliers ont été atteints grâce à ces techniques.

Les techniques d’isotachophorèse utilisent la discontinuité de composition des électrolytes de séparation. En effet, le capillaire est constitué de trois zones de conductivité différente : un électrolyte dont la mobilité électrophorétique est plus importante que celle de la zone échantillon car il contient un co-ion de haute mobilité, électrolyte meneur, un électrolyte dont la mobilité électrophorétique est plus faible, électrolyte terminal, et la zone échantillon comprise entre ces deux zones d’électrolytes. Lorsque la tension est appliquée sur le capillaire, un gradient de potentiel se développe entre les deux zones d’électrolyte, donc dans la zone échantillon, où chaque soluté constitue alors sa propre zone, migrant toutes à la même

vitesse, dictée par l’électrolyte leader. Cette technique est particulièrement utile lorsque les échantillons présentent des ions conducteurs. [2,3].

● Le sweeping met à profit la présence d’une pseudo-phase permettant ainsi de préconcentrer les composés neutres. Le sweeping a été décrit initialement dans des conditions de CEMC mettant en œuvre une pseudo phase stationnaire micellaire. La préconcentration par sweeping correspond à l’accumulation des analytes via des interactions avec une pseudo phase stationnaire qui pénètre dans la zone échantillon sous l’application d’une tension [4]. Les pseudo phases peuvent être des micelles ou des agents de complexation tels que le borate. Des augmentations de la sensibilité de 80 à 5000 ont été observées.

Les techniques chromatographiques en EC utilisent la présence d’une phase stationnaire sur une faible longueur du capillaire, s’assimilant ainsi à de l’extraction sur phase solide couplée en ligne à de l’EC. La technique consiste donc à remplir l’entrée du capillaire par une phase stationnaire de CPL. La solution échantillon est introduite hydrodynamiquement et l’élution a lieu à l’aide d’une phase mobile plus éluante que le milieu d’injection. Cette technique a été développée sur diverses phases stationnaires plus ou moins spécifique et des augmentations du facteur de sensibilité de 500 à 7000 ont été observées. Cependant, elle présente des inconvénients non négligeables tels que des temps d’analyse longs, des traînées de pics, des pertes d’efficacités comparées à des méthodes purement électrophorétiques.

2. 2 Préconcentration couplée en ligne avec la chromatographie en phase liquide

Les techniques de préconcentration en CPL permettent d’étudier des composés à l’état de traces et l’avantage des méthodes en ligne est leur automatisation simple à réaliser. En chromatographie en phase liquide la préconcentration en ligne est mise en œuvre grâce à un système de précolonne reliée à une colonne analytique par un système de vannes et de pompes permettant ainsi de percoler les volumes importants d’échantillon sur la précolonne seule puis après piégeage de ceux-ci, de les entraîner vers la colonne analytique avec une phase mobile de force éluante suffisante en vue de la séparation, ceci étant représenté sur la Figure 75.

Figure 75 : Schéma d’un système d’extraction, de préconcentration en ligne couplé à la CPL par une vanne 6 voies à deux positions.

Un tel système permet le choix des phases stationnaires utilisées, elles peuvent être de fonctionnalités différentes entre la précolonne et la colonne en fonctions des besoins analytiques. Selon les solutés à étudier, elles peuvent être adaptées pour répondre à des extractions et séparations plus ou moins spécifiques. Pour la recherche de composés neutres plus ou moins hydrophobes dans des échantillons aqueux, les phases stationnaires permettant de bien retenir ces composés doivent présenter des groupements apolaires. L’élution des composés préconcentrés a ensuite lieu par un gradient eau - acétonitrile qui permet à la fois de désorber, de transférer les solutés de la précolonne à la colonne analytique, tout en assurant la séparation de ces composés sur cette dernière colonne [5]. De par la configuration du montage, il est possible de faire varier le volume percolé sur la précolonne et ainsi connaître quel est le volume de fin de fixation du composé sur la phase stationnaire sélectionnée. Ce volume est défini comme étant le volume maximum percolable permettant un rendement d’extraction (rapport entre la quantité récupérée après élution en ligne et la quantité percolée sur la précolonne) de 100%. Ce volume de fin de fixation dépend de l’hydrophobie des composés et peut être facilement calculé à partir de la valeur estimée du facteur de rétention dans l’eau pure.

Lors du transfert des solutés de la précolonne vers la colonne il peut y avoir un phénomène d’élargissement de bande. C’est pourquoi l’analyse quantitative se fait à partir de solution étalon dopée subissant la préconcentration en ligne, en utilisant les hauteurs ou les aires des pics. Quand l’extraction liquide – solide a lieu sur une cartouche d’extraction, on définit usuellement un facteur d’enrichissement en volume qui est égal au rapport entre le volume percolé sur la cartouche et le volume de l’extrait. Quand l’extraction liquide – solide est suivie d’une analyse chromatographique en ligne, le facteur d’enrichissement exprimé en volume

Echantillon pompe pompe analytique phase mobile colonne analytique poubelle précolonne

n’a plus de sens. On définit plutôt une concentration minimale détectable qu’on peut calculer à partir du volume maximal percolable et de la limite de détection du système colonne analytique – détecteur.

Il n’est pas usuel de définir un facteur FES dans ce cas, cependant s’il était utilisé, il serait plus correct de le définir avec le rapport des aires des pics et non des hauteurs pour tenir compte de l’élargissement de bande possible.

2. 3 En électrochromatohraphie capillaire

2. 3. 1 Techniques développées pour la préconcentration

Des méthodes de préconcentration en tête de colonne ont été développées sur plusieurs types de phase stationnaire : particulaires [6,7], sol-gel [8,9] et monolithiques [10,11]. Etant donné que l’ECC fait intervenir une phase stationnaire et l’application d’un champ électrique, les principes de préconcentration décrits dans les paragraphes précédents peuvent être adaptés. En effet, il est possible d’utiliser des techniques de préconcentration sous champ, issues des méthodes électrophorétiques [3]. Il est aussi possible de développer des méthodes de préconcentration utilisant la présence d’une phase stationnaire, issue des méthodes employées en CPL. Ce sont ces dernières qui ont été le plus développées en ECC Des composés neutres ont d’abord été étudiés et préconcentrés grâce à cette technique mais aussi des composés chargés. Elle utilise ainsi une phase stationnaire apolaire et un milieu échantillon de composition moins éluante que celui de la phase mobile, ce qui permet d’observer un phénomène de préconcentration en tête de colonne [7,9]. Ensuite, les composés sont élués avec une phase mobile plus éluante qui permet à la fois une bonne rétention et une bonne résolution des composés [7,10]. C’est pourquoi des pourcentages en solvant organique compris entre 75 et 95 % en volume sont généralement utilisés. Par ailleurs, comme cette technique s’apparente à celle de la CPL en ligne, le volume percolé peut être supérieur à la colonne tant qu’il ne dépasse pas le volume de fin de fixation défini pour un composé.

L’influence de la longueur de la zone injectée, c'est-à-dire du volume percolé, sur la largeur du pic obtenu sur des colonnes à base de sol-gel photopolymérisé [8,9] ou de particules d’ODS [6,7] a été évaluée, et ce sur des composés très divers. Au-delà d’un certain volume de zone injectée, dépendant du composé étudié, l’élargissement des pics devient trop important, et il n’y a plus de phénomène d’enrichissement, la phase stationnaire semble saturée, sa

[9] et même 22 000 pour la benzoïne [11]. Par ailleurs, les facteurs d’enrichissement augmentent avec la valeur du facteur de rétention.

De par la présence d’une phase stationnaire, le volume mesuré par la longueur injectée n’est pas un paramètre facilement accessible, c’est pourquoi le temps d’injection et la tension appliquée sont généralement utilisés pour indiquer l’importance de l’étape de préconcentration mise en oeuvre. Cependant, Quirino et al [9] calculent la longueur de la zone injectée connaissant le temps de percolation de la solution échantillon et la vitesse linéaire d’un marqueur de flux dans les conditions d’élution. Or, ce calcul ne tient pas compte des conditions de l’étape de préconcentration. En effet, la composition de la zone injectée étant différente de celle de la phase mobile contenue initialement et lors de l’élution, cela induit une modification du flux électroosmotique, donc de la vitesse linéaire lors de l’analyse. Cette modification du FEO varie avec l’importance de la zone d’injection et fait donc varier la vitesse linéaire de la phase mobile lors de l’étape d’élution. C’est pourquoi leur calcul de la zone échantillon doit être pris à titre indicatif.

Le mode d’injection, hydrodynamique ou électrocinétique, n’a pas d’influence sur l’enrichissement des composés lorsqu’ils sont neutres, comme dans la plupart des cas décrits. Quelques études récentes ont porté sur les composés chargés et des facteurs de préconcentration de l’ordre de 24 000 pour la cafféine [11] ont été déterminés. Pour obtenir de tels facteurs de préconcentration il faut associer des méthodes de préconcentration dues aux interactions avec la phase stationnaire à celles utilisant les champs électriques lors de la séparation. En effet, la concentration en électrolyte dans la matrice de l’échantillon est plus faible que celle de la phase mobile. Ainsi, lors de l’application d’une tension, le champ électrique mesuré sur cette zone échantillon est plus important que celui de la zone d’élution. Par conséquent, les analytes chargés migrent rapidement à l’intérieur de la zone échantillon jusqu’à la frontière avec une des zones de phase mobile où leur vitesse se trouve alors réduite. La zone d’analytes se trouve alors réduite, condensée et la préconcentration est ainsi plus importante.

2. 3. 2 Evaluation d’un facteur d’enrichissement en signal

L’évaluation de l’importance du phénomène de préconcentration se mesure par le facteur d’enrichissement en signal (FES) qui est théoriquement défini par le rapport entre le signal obtenu après préconcentration et avant préconcentration (par injection directe). Le facteur

d’enrichissement en signal (FES) peut être mesuré par le rapport des hauteurs ou par le rapport des aires.

0 h h FES = 0 A A FES =

h et A étant la hauteur et l’aire du pic après concentration et h0 et A0 étant la hauteur et l’aire

du pic par injection directe. S’il n’y pas d’élargissement de bande lors de la préconcentration alors FES(h) et FES(A) sont égaux.

Dans la pratique, si on a besoin d’enrichir c’est qu’aucun signal n’est obtenu pour l’échantillon. Dans ce cas, l’utilisation d’une solution de référence diluée, qui donne un signal au-delà de la limite de détection, peut être utilisée pour calculer le FES.

Pour la mesure du FES(A) on utilise l’aire corrigée des pics (rapport de l’aire sur le temps de rétention du composé) car elle permet de corriger les modifications de flux électroosmotique dues aux variations de la composition des phases liquides dans le capillaire. Le facteur d’enrichissement en signal est le moyen de chiffrer l’enrichissement lors de la préconcentration. Il n’est pas utilisé pour l’analyse quantitative, cette dernière étant réalisée par des solutions étalons subissant tout le protocole de préconcentration afin de tenir compte d’éventuels élargissements de bandes ayant lieu lors de la préconcentration en tête de colonne. Ces derniers sont parfois difficiles à éviter et sont fonction des caractéristiques des solutés. On définit la concentration minimale détectable qui correspond à la concentration de la solution qui une fois préconcentrée donne un signal égal à trois fois le bruit de fond autrement dit la limite de détection par injection directe.

3. Méthodes et conditions utilisées pour la préconcentration en