δe maintien de l‟intégrité du génome de génération en génération est indispensable à la survie des espèces. δ‟ADζ des organismes est constamment soumis à des agressions physiques et
chimiques plus ou moins intenses et pouvant varier au cours du temps. Il n‟est donc pas rare que des dommages à l‟ADζ surviennent. Il existe des mécanismes de détection et de réparation des dommages à l‟ADζ qui, s‟ils ne sont pas fidèles, génèrent des lésions persistantes qui pourront être transmises aux générations futures.
Bien que la structure en double hélice de l'ADN offre une protection contre les coupures glycosidiques et les désaminations, les hautes températures participent, entre autres, à l'accélération de la réaction de désamination des bases nucléotidiques de l'ADN adénine et cytosine (Lindahl and Karlstrom, 1973 ; Lindahl and Nyberg, 1974 Lindahl, 1979 ; Shen et al., 1994). L'ADN simple brin est formé transitoirement pendant la transcription, la réplication et la recombinaison. C‟est au cours de ces processus que les bases cytosines et adénosine de l‟ADζ sont particulièrement vulnérables. Une des réactions chimiques courantes est la désamination de la cytosine et de l‟adénine qui donne respectivement l‟uracile et l‟hypoxanthine par hydrolyse d‟un groupement amine –NH2. δ‟uracile, possédant une structure chimique proche de celle de la thymine, peut s‟apparier à une adénine
donnant une transition C:G Æ T:A à la prochaine génération de cellules. Ce dommage est donc hautement mutagène.
Dans la cellule, deux lignes de défense contre la réaction de désamination de la cytosine ont été identifiés à ce jour. Un des mécanismes consiste en l‟élimination de la base uracile. Il est initié par
des glycosylases spécifiques de l‟uracile (Pearl, 2000) et est ensuite pris en charge par les voies de
réparation de l‟ADζ. En effet, des UDG (Uracil DζA Glycosylases) ont été identifiées chez des organismes thermophiles (Sandigursky and Franklin, 1999 ; Starkuviene and Fritz, 2002). Tout récemment, une UDG a été isolée et caractérisée chez une Archée du genre Pyrococcus (Li-bo et al., 2012). Une autre voie existe au sein de la cellule et consiste en l'ajustement de la concentration cellulaire en dUTP (Vértessy et al, 2009). Une troisième ligne de défense spécifique est présente au sein même de certaines ADN polymérases. Il s'agit d'une reconnaissance structurale de l'uracile. Ce mécanisme a été vu en détail dans la deuxième partie du chapitre I de ce manuscrit (page 48), il participe à la haute fidélité des pols réplicatives archéennes. C'est un mécanisme moléculaire de lecture en amont de la base uracile (Greagg et al., 1999). Il induit un arrêt de la polymérisation qui
permet ensuite l'intervention des mécanismes de réparation de l‟ADζ, il s‟agit en quelque sorte d‟un mécanisme d‟alerte précoce, signalant une anomalie de la réplication.
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En collaboration avec les cristallographes εarc Delarue et Jérôme Gouge de l‟Unité de Dynamique Structurale des εacromolécules de l‟Institut Pasteur à Paris, nous avons cherché à comprendre plus en détail le phénomène de reconnaissance de la base endommagée uracile par l'ADN polymérase B de Pyrococcus abyssi au cours de la synthèse d‟ADζ. Par une approche
méthodologique complémentaire, à la fois structurale et fonctionnelle, nous avons tenté de
comprendre les mécanismes qu‟utilise PabPolB, dépourvue de sa fonction exonucléasique, pour
discriminer les bases endommagées des bases canoniques en cours de synthèse de l'ADN.
Des cristaux de PabPolB ont été obtenus puis la structure tridimensionnelle de PabPolB en
complexe avec une construction amorce/matrice d‟ADζ contenant une base désaminée uracile a été
résolue. La structure cristallographique obtenue, hautement résolutive, a révélé l'existence, au sein du domaine N-terminal, d'une structure en « T-cleft » située sous la poche de reconnaissance de
l‟uracile. Cette structure implique trois acides aminés qui chélatent un ion métallique divalent par
l'intermédiaire de six molécules d'eau, formant ainsi une sphère d'hydratation. La présence de six
molécules d‟eau autour d‟un métal est rare dans les structures cristallographiques des protéines mais plus courant dans les structures d‟oligonucléotides. De plus, en raison de sa proximité avec la poche
de reconnaissance à l'uracile, l‟hypothèse proposée est que ce T-cleft jouerait un rôle dans la liaison à
l‟ADζ et dans la reconnaissance de dommage. Ainsi, deux hypothèses ont été émises quant au rôle
de l‟ion métallique divalent :
i) δe métal sert de guide à l‟ADN pour passer dans le T-cleft.
ii) δe métal permet à PabPolB d‟effectuer une reconnaissance de l‟uracile, de marquer une pause dans la polymérisation et ainsi d‟augmenter la discrimination entre une base lésée et une base
canonique. Ces hypothèses, qui reposent sur des résultats de données structurales, ont été étudiées
d‟un point de vue fonctionnel. Pour cela, des mutations ponctuelles des acides aminés de PabPolB formant le T-cleft impliqué dans la liaison à l'ion métallique ont été effectuées (D4A (acide aspartique
Æ alanine, E251A (acide glutamique Æ alanine), D343A) rendant ainsi les acides aminés moins
hydrophiles, et de fait, abolissant les liaisons avec la sphère d‟hydratation. δ‟étude fonctionnelle s‟est déroulée de la façon suivante :
- Production et purification de PabPolB et de ses mutants (Annexe 1, pages 189-190).
- Contrôle quantitatif (dosage de la concentration) et qualitatif (pureté (Annexe 2, page 190), activité exonucléase) des protéines purifiées.
- Mise au point des conditions expérimentales pour la mesure des activités ADN polymérases
et comparaison de la cinétique d‟extension d‟amorce hybridée à de l‟ADζ sain ou de l‟ADζ
endommagé par les PabPolBs.
- Mesure de la capacité de liaison des PabPolBs aux matrices saines et endommagées en présence ou non d'ion métallique Mg2+.
L'ensemble des résultats obtenus a été valorisé sous la forme de publication scientifique dans la revue scientifique « Journal of Molecular Biology », (voir ci-après).
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