présente les principaux procédés et leur caractéristiques.

Tableau I.3. Procédés de fabrication d’alcool.

Type du procédé

Procédé Caractéristiques

Cuve-mère (De Miniac 1988 et 1991)

• Utilisation d’un fermenteur aéré appelé « cuve-mère » où la biomasse est produite pendant chaque cycle de fermentation à partir du moût avec une teneur en sucre faible (70 g/L).

• Température de fermentation : 33°C. • Concentration finale obtenue : 70 à 80 g/L. • Productivité varie entre 2.8 et 3.2 g/L/h selon

le substrat utilisé. Procédé en

discontinu

Reprise de levure (De Miniac 1988 et 1991 ; Délia-Dupy et coll., 1995)

Réutilisation de la biomasse provenant de la fermentation, mais concentré par centrifugation.

• Température de fermentation : 33°C. • Productivité est de l’ordre de 2.0 à 4.4 g/L/h

Multi-étages (Molle, 1988)

• Utilisé par les Sociétés Speichim et Vogelbush.

• Procédé simple en continu

• Utilisable pour des substrats dilués ou concentrés

Procédé en continu

BIOSTIL (Riba et Goma, 1981 ; De Miniac, 1991)

• Procédé avec recyclage et extraction simultanée de l’éthanol sous vide.

• Elimination de l’inhibition par l’éthanol • Fermentation de substrats très concentrés en

un temps très court.

1.2.2. Principaux paramètres du procédé

Il faut que la fermentation alcoolique se déroule dans les meilleures conditions pour obtenir un produit de bonne qualité. Pour cela on doit prendre en compte certains facteurs qui vont influer sur la croissance de la levure et son maintien en activité jusqu’à la fin de la fermentation. Ces facteurs sont : les constituants du moût (la teneur en sucres, l’acidité du moût, le taux de non-sucre), la nature de la souche de levure et l’aération. Le degré d’alcool atteint va dépendre de la teneur en sucre dans le moût de fermentation. Le moût doit être acide afin d’éviter tout risque de contamination bactérienne. Le taux de non-sucre va fournir les éléments nutritifs minéraux et organiques pour la levure. Enfin, une faible aération va permettre d’assurer la biosynthèse des stérols des membranes cellulaires nécessaires au maintien la viabilité cellulaire. Ainsi, le bilan fermentaire et la productivité sont favorisés par l’oxygène. Les paramètres exposés vont conduire à des variations sur le rendement en alcool, sa cinétique de production et la formation de sous produits

1.2.3. Contamination microbienne dans l’industrie de production d’alcool (distillerie)

Dans la fabrication d’alcool industriel, des problèmes liés à une contamination du milieu par des micro-organismes « sauvages » (Maiorella et coll., 1984 ; Essia Ngnag et coll., 1989 ; Délia-Dupuy et coll., 1993 ; Almeida Tavares et coll., 1995) sont assez fréquemment observés. Le milieu fermentaire est envahi par le microorganisme contaminant au détriment de la souche mise en œuvre (Saccharomyces cerevisiae). Dans le cas des contaminations par des bactéries lactiques dans la plupart des cas, le problème est à ce jour bien maîtrisé avec le contrôle de l’acidité et l’emploi d’antibiotiques comme la pénicilline. En revanche, les contaminations par des levures posent un problème plus complexe.

Le premier cas de contamination par Brettanomyces a été décrit par De Miniac en 1989 sur un site fonctionnant selon le procédé BIOSTIL. Depuis, le nombre de cas recensés n’a cessé d’augmenter. Les pertes économiques sont très importantes et les causes de ces contaminations demeurent encore mal expliquées. A l’heure actuelle le problème ne peut être résolu que par la vidange complète de la cuverie, suivie d’une remise en route après désinfection des circuits.

En étudiant (dès 1989) ce premier cas de contamination par la levure Brettanomyces de Miniac a proposé le schéma suivant (figure 1.2): pendant les premiers jours de la fermentation, tout se déroule normalement, la concentration en levures Saccharomyces est de 60x106 cellules/ml en régime permanent. A partir du 7ème jour de la fermentation les premières cellules de Brettanomyces apparaissent et se développent très rapidement. On observe alors une chute rapide de la population des Saccharomyces avec comme conséquence un baisse importante de la productivité (d’environ 20%). Cette contamination est aussi accompagnée par une forte augmentation de l’acidité du milieu de fermentation (jusqu’à 7 g/L équivalent en acide sulfurique). Dans ces mêmes travaux De Miniac a montré que la croissance de ces levures était stimulée par l’oxygène (Effet Custer) et par un pH élevé.

800 900 1000 1100 1200 0 5 10 15 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 10 15 0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 PRODUCTION D’ALCOOL hl/jour LEVURES 106_germes/ml ACIDITE EN FERMENTATION g/l acide sulfurique

Biosynthèse d’acide acétique par Brettanomyces Saccharomyces cerevisiae Bre ttan om yces int erm ediu s

7ème jour: début de contamination par

Brettanomyces 800 900 1000 1100 1200 0 5 10 15 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 10 15 0 1 2 3 4 5 6 7 0 5 10 15 PRODUCTION D’ALCOOL hl/jour LEVURES 106_germes/ml ACIDITE EN FERMENTATION g/l acide sulfurique

Biosynthèse d’acide acétique par Brettanomyces Saccharomyces cerevisiae Bre ttan om yces int erm ediu s

7ème jour: début de contamination par

Brettanomyces

Figure 1.2. Contamination d’une unité de fermentation alcoolique par Brettanomyces

Par la suite il a été montré que les (six) sites industriels sur lesquels les auteurs ont trouvé la présence de Brettanomyces n’avaient entre eux aucun point commun que ce soit leur position géographique, la matière première mise en fermentation, le milieu utilisé, ou le procédé de fermentation alcoolique (Délia-Dupuy et coll., 1995). Il apparaissait que les contaminations par Brettanomyces étaient une conséquence d’erreurs de conduite de l’atelier. Une étude ultérieure (Gilis 1999) montrait que deux facteurs exerçaient un rôle majeur: aération et acidité. Dans des conditions d’excès d’air et de manque d’acidité, Brettanomyces s’implante dans le milieu de fermentation en formant à la surface des cuves un mousse compacte de couleur marron clair et d’aspect crémeux.

1.3. Le genre Brettanomyces

Les travaux réalisés sur le genre Brettanomyces peuvent être classées en trois catégories :

(1) études sur le rôle de ces levures comme contaminants en vinification ou en élaboration d’alcool industriel,

(2) études portant en vinification sur les défauts analytiques et sensoriels imputables à ces micro-organismes,

(3) études sur les aspects métaboliques et cinétiques de la croissance

A ce jour, les recherches ont principalement porté sur les points (1) et (2). Par contre, il y a peu de données bibliographiques sur les aspects cinétiques et métaboliques.

1.3.1. Taxonomie et morphologie de Brettanomyces

Les levures du genre Brettanomyces sont connues depuis 1904 comme impliquées dans la deuxième fermentation des bières (Peynaud et Domercq, 1956) et ont été depuis mises en évidence dans la majorité des boissons fermentaires comme la bière, le vin ou le cidre (Chatonnet P. et coll., 1995 ; Heresztyn T., 1986 ; Larue F. et coll., 1991) et dans les unités de production d’alcool industriel (De Miniac M., 1989 ; Délia-Dupuy et coll., 1997).

Le genre Brettanomyces est considéré comme la forme imparfaite du genre Dekkera appartenant aux ascomycètes. Les espèces de Brettanomyces les plus connues sont: bruxellensis, intermedius, anomalus, abstinens, clausenii.

La morphologie de ces levures peut changer en fonction des conditions du milieu de culture (Aguilar-Uscanga et coll., 2000). Elles peuvent être sphéroïdes, ogivales, cylindriques, allongées. Bien que plus petites que Saccharomyces elles sont facilement visibles au microscope optique et elles apparaissent isolées, en paire ou formant des petites chaînes et des pseudomycelium. Ces cellules se multiplient par bourgeonnement multipolaire (Van der Walt, 1970 ; Shung-Chang et coll., 1985). En reproduction sexuée (Dekkera), elles forment des asques contenant 1 à 4 ascospores. Leur croissance est lente et elles donnent d’importantes quantités d’acide acétique à partir des sucres.

En conditions de stress ces levures Brettanomyces, deviennent très petites et peuvent traverser les membranes au seuil de coupure de 0.45µm. Sous cette forme, elles sont considérées comme viables mais non cultivables (VNC) c'est-à-dire capables de reprendre une croissance normale après une culture d’enrichissement (Millet et Lonvaud, 2000).

1.3.2. Aspects physiologiques et métaboliques

Les levures du genre Brettanomyces ont un métabolisme de type fermentatif ou oxydatif

(figure 1.3) selon l’espèce considérée et les conditions de culture.

La première étape de transformation du glucose suit la voie d’Embden Meyerhof Parnas (EMP) aussi appelée glycolyse. Cette étape qui se déroule dans le cytosol est commune pour la respiration et la fermentation. Elle comprend une série de dix réactions, chacune catalysée par une enzyme spécifique. La glycolyse conduit à la formation de 2 molécules de pyruvate à partir duquel les voies de respiration ou de fermentation seront activées.