L’ensemble des résultats de notre étude sur la structure du domaine THAP de THAP1 et de son interaction avec l’ADN a donné lieu à une publication. Nous proposons de reprendre brièvement les résultats publiés dans cet article qui est inséré ensuite au paragraphe suivant.
L’article présente l’identification du domaine THAP restreint à 81 acides aminés au lieu de 90, sa structure en solution, l’identification de l’interface de liaison à l’ADN par mutagénèse dirigée et variations de déplacement chimique et également l’étude par RPS (résonance plasmonique de surface) de l’interaction du domaine THAP de THAP1 avec sa séquence ADN cible.
Ce travail est l’objet d’une collaboration avec l’équipe de biologie vasculaire de l’IPBS. Les expériences de mutagénèse dirigée et de gel retard ont été réalisées par Chrystelle Lacroix, doctorante dans cette équipe.
Dans ce chapitre nous faisons référence aux figures de l’article.
Caractérisation biophysique du domaine THAP de THAP1
Le domaine THAP, comme nous l’avons vu, est à l’origine défini par les 90 résidus N-terminaux de THAP1 (Roussigne et al., 2003b).
Nous avons réalisé les premières expériences de RMN sur ce domaine ainsi que des expériences de RPS.
Pour les expériences de RPS, nous avons enregistré les sensogrammes (mesure du signal RPS en fonction du temps) correspondant à l’injection de protéine sur les molécules d’ADN immobilisées. Nous avons travaillé simultanément avec une séquence d’ADN comprenant la séquence consensus reconnue par le domaine THAP de THAP1 et une séquence d’ADN aléatoire. De cette façon, nous pouvons étudier la réponse spécifique en réalisant la soustraction des deux sensogrammes. Nous avons réalisé l’étude de la liaison en injectant la protéine à différentes concentrations (fig 1 A). Nous avons ainsi pu déterminer une constante de dissociation (KD) globale de 8 µM, spécifique, et une stœchiométrie de 1 : 1, à partir de la courbe des réponses à l’équilibre en fonction de la concentration en protéine (fig 1 B).
Nous avons réalisé l’attribution du domaine 1-90 avec la stratégie déjà décrite. Mais nous n’avons qu’une attribution partielle de la partie C-terminale (78 à 90) pour laquelle nous avons observé très peu de NOEs non séquentiels. Cette partie présente de plus des valeurs de NOE heteronucléaires négatives indiquant que l’extrémité C-terminale du domaine n’est pas structurée. Nous avons donc cherché à déterminer un domaine de taille plus courte, capable de lier spécifiquement la cible ADN consensus. Nous avons pu identifier un domaine de 81 résidus {Met1-Phe81} dont nous avons résolu la structure.
Structure par RMN en solution du doigt de zinc THAP de THAP1
Nous avons déterminé la structure tridimensionnelle du domaine THAP {Met1-Phe81} de THAP1 comme nous l’avons précédemment décrit. Les contraintes de distances et d’angles sont répertoriées ainsi que les statistiques structurales (Table 1).
Le cœur de la structure adopte une architecture βαβ (fig 2 A-B). L’hélice α est composée des résidus 33 à 40 et les deux brins β des résidus 22 à 24 et 52 à 54. Les résidus Cys5, Cys10, Cys54, et His57 forment le site de coordination au zinc. Trois courtes hélices 310 sont formées par les résidus 55 à 57, 60 à 63 et 79 à 81. L’analyse des NOEs hétéronucléaires nous a permis d’apprécier les parties mobiles (sur l’échelle des temps ps-ns) en accord avec les régions moins bien définies sur l’ensemble des structures générées (fig 2 C et fig supplémentaire 1).
Les protons amides protégés de l’échange H2O/D2O correspondent à des résidus dans l’hélice α (résidus 35, 36, 37, 39 et 40) le feuillet β (résidus 53 et 54) et des résidus proches du site de liaison au zinc (résidus 6, 7 10 et 12). Ces protons protégés sont situés dans des régions rigides (fig 2 C) présentant des éléments de structure secondaire ou étant structurés par la liaison au zinc. Tous les autres protons amides s’échangent rapidement avec le solvant.
Parmi les résidus conservés du domaine THAP, le tryptophane 36 situé sur l’hélice α est un élément clef de la structure, au centre d’un cœur hydrophobe. Le motif conservé AVPTIF joue un rôle essentiel dans le repliement de la protéine en reliant l’hélice α et la partie C-terminale.
Une séquence ADN cible non partagée parmi les domaines THAP
Les structures en solution de deux autres domaines THAP ont été récemment déterminées, la structure du domaine THAP de THAP2 humaine (code PDB : 2d8r) et le domaine THAP de CtBP (Caenorhabditis elegans C-terminal binding protein) (code pdb 2jm3) (Liew et al., 2007).
Nous avons cherché à savoir si ces domaines qui semblent partager la même structure globale tridimensionnelle (fig3 A) étaient capables de reconnaître la même séquence consensus reconnue par THAP1. Nous avons montré que les domaines THAP de THAP2 et THAP3 ne liaient pas cette séquence ADN de façon spécifique (fig 3 B). Le domaine THAP de CtBP se lie à cette séquence mais pas de façon spécifique tout comme le domaine THAP de GON-14 (fig 3 C).
Analyse structure-fonction du domaine THAP de THAP1 par mutagénèse dirigée
Dans le but de définir les résidus nécessaires pour la liaison à l’ADN, des analyses par mutagénèse dirigée ont été menées dans l’équipe de biologie Vasculaire par C. Lacroix. Les liaisons à l’ADN de 30 simples mutants et 6 triples mutants de résidus en alanines ont été testées par gel retard (Fig 4 A-D et table 2).
Six résidus sont identifiés dont la mutation ponctuelle abolit complètement la liaison à l’ADN : les résidus 36, 24, 29, 42, 45 et 48. Il apparaît évident que la mutation du tryptophane 36 au centre du cœur hydrophobe entraîne la déstructuration de la protéine qui n’est plus capable de lier l’ADN. De même les résidus 29 et 45 sont orientés à l’intérieur de la protéine et ont un rôle structural, leur mutation pourrait provoquer une déstructuration de la protéine (fig 4 E). Par contre les résidus 24, 42 et 48 sont exposés à la surface de la protéine et sont situés sur une aire chargée positivement, présentant de nombreuses lysines et arginines, (fig 4 F) qui suggère que ces trois résidus sont directement impliqués dans la liaison à l’ADN.
Identification de la surface de liaison du domaine THAP avec l’ADN par variations de déplacements chimiques
Dans le but de caractériser la surface de liaison à l’ADN, nous avons réalisé la titration du domaine THAP marqué 15N par l'ajout d'ADN en enregistrant des spectres
15N HSQC à différents rapports ADN/Protéine.
Lorsque nous ajoutons de l’ADN de séquence aléatoire nous n’observons pas de variation de déplacement chimique. Par contre lors de l’ajout d’ADN de séquence consensus, plusieurs pics de corrélations sont affectés (fig 5A).
Après l’ajout d’ADN à un ratio protéine:ADN de 1:1 plus aucune variation n’est observée, confirmant la stœchiométrie 1:1 du complexe.
Les acides aminés affectés par la liaison à l'ADN sont identifiés par comparaison des déplacements chimiques 15N et de 1H amides de la protéine libre et en complexe avec l’ADN (fig 5 B). Ils sont regroupés en trois zones, formées des résidus (7, 8, 11, 13, 20, 52, 53, 54, 56) proche du site de liaison au zinc, (29, 36, 38, 39) proche de l’hélice α et (68, 69, 70, 72, 76) dans une boucle rigide (L4, fig 2 B de l’article) située entre les deux hélices 310 C-terminales. De façon intéressante, les résidus présentant les plus grandes variations de déplacement chimiques sont situés sur la surface chargée positivement identifiée également par mutagénèse (fig 4 F), soulignant le rôle pressenti de cette région comme surface d’interaction avec l’ADN.