Présentation de la fonctionnalisation

Les gouttes d’huile d’émulsion de la taille de quelques micromètres peuvent être assez facilement recouvertes (ou fonctionnalisées) par des molécules biologiques comme la streptavidine ou la biotine. En général, ces molécules sont soit des ligands, soit des récepteurs, rendant ainsi les gouttes adhésives entre elles [42], à des substrats solides [38], ou encore avec des cellules du système immunitaire [39]. Après une présentation des constituants principaux de la liaison goutte-anticorps, nous donnons une représentation du lien chimique final.

1) Phospholipides biotinylés

Le lien du côté de la goutte d’huile est assuré grâce à la dissolution dans l’huile de phospholipides fonctionnalisés, caractérisés par une partie lipophile (ayant une affinité avec l’huile) et une partie hydrophile (ayant une affinité avec l’eau). La Figure 64A montre la formule chimique et la représentation de ces molécules.

Le phospholipide utilisé se compose de trois parties : le phospholipide DSPE (masse molaire de 748 g/mol) avec sa tête hydrophile et ses deux queues aliphatiques lipophiles, le polymère PEG (polyéthylène glycol, masse molaire de 2000 g/mol) représenté par une pelote enchevêtrée, et la biotine (masse molaire de 244 g/mol).

132

Figure 64. (A) Formule chimique du phospholipide DSPE-PEG biotinylé utilisé dans la fonctionnalisation des gouttes d’huile de soja. Elle est constituée de trois entités chimiques : (i) le phospholipide DSPE représenté par une tête hydrophile et deux longues chaînes carbonées hydrophobes, (ii) le polymère PEG (polyéthylène glycol) représenté par une chaîne sous forme de « pelote » enchevêtrée, (iii) la biotine. (B) Représentation de la position des phospholipides DSPE-PEG biotinylés dissous dans une goutte d’huile dispersée dans une solution aqueuse de surfactants. La tête hydrophile des phospholipides est en contact avec la phase aqueuse tandis que leurs chaînes carbonées hydrophobes sont dans l’huile. La goutte est alors recouverte de biotine en surface.

La Figure 64B montre la position des phospholipides dissous dans une goutte d’huile d’émulsion. Du fait de leur caractère amphiphile, ils migrent à l’interface huile/eau. En effet, pour chaque phospholipide, les deux chaînes aliphatiques sont du côté de la phase huileuse, alors que la partie polaire composée de la partie polaire du DSPE, du PEG et de la biotine, sont du côté de la phase aqueuse. La goutte est donc finalement recouverte de molécules de biotines, qui elles-mêmes peuvent réagir avec d‘autres molécules, comme la streptavidine par exemple.

2) Lien entre la goutte d’huile et la cellule B

Nous avons présenté les molécules pouvant être liées à la surface d’une goutte d’huile d’émulsion d’un côté, et la structure des récepteurs membranaire à la surface d’une cellule B (voir partie 2.1) de l’autre. Nous allons décrire à présent le lien entre ces deux parties, réalisé grâce à l’affinité forte de deux protéines, la streptavidine et la biotine.

Le schéma de ce lien chimique entre la goutte et la cellule B est représenté sur la Figure 65. Comme expliqué plus haut, la dissolution de phospholipides biotinylés permet de couvrir la

133 surface de la goutte en biotine. En effet, la chaîne carbonée d’un phospholipide reste préférentiellement du côté de l’huile car elle est hydrophobe, tandis que la tête polaire du phospholipide et la biotine, groupe hydrophile, restent du côté de la solution aqueuse.

Figure 65. Schéma du lien entre une cellule B et une goutte d’huile. Le récepteur membranaire de la cellule B reconnaît l’anticorps F(ab’)2 biotinylé. La biotine liée à celui-ci s’attache à la streptavidine de manière forte (constante de dissociation Kd ≈ 10-14 mol/L). La biotine liée au phospholipide DSPE-PEG s’attache également à la streptavidine. Ce phospholipide est attaché à la goutte d’huile grâce au caractère hydrophobe de ses chaînes carbonées. Dans notre expérience, la streptavidine est fluorescente.

La streptavidine (représentée en bleu clair sur la Figure 65) se lie à la biotine avec une grande affinité (constante de dissociation 𝐾_𝐷 ≈ 10−14mol/L ). A ce stade, il nous faut un intermédiaire entre la streptavidine et le récepteur membranaire de la cellule B. Nous avons choisi d’utiliser un anticorps F(ab’)2 fonctionnalisé avec de la biotine. Un anticorps F(ab’)2 est un anticorps dont la partie Fc a été fragmentée sous l’action de la pepsine (voir Figure 13). Cet anticorps F(ab’)2 réagit avec les chaînes légères de l’anticorps membranaire de la cellule B (source : « Jackson ImmunoResearch »), tandis que la biotine liée à cet anticorps F(ab’)2 réagit avec la streptavidine.

Dans notre expérience, la streptavidine est liée à un fluorophore qui permet sa visualisation au microscope à épi-fluorescence. C’est la streptavidine qui est fluorescente dans notre expérience, et pas les anticorps F(ab’)2, car, à notre connaissance, il n’existe pas d’anticorps F(ab’)2 liés à un fluorophore dans le commerce.

134

3) Affinité des différents liens

Nous avons décrit les différentes composantes du lien entre une goutte d’huile d’émulsion et une cellule B. Dans le modèle d’une association entre un ligand et un récepteur, la force de liaison entre deux protéines peut être mesurée par la constante de dissociation 𝐾_𝐷. Notons que ce lien repose sur des interactions de type van der Waals (dipôle-dipôle) entre les différentes protéines impliquées. La réaction entre un ligand A et un récepteur B a pour équation :

𝑘_𝑜𝑛 𝐴 + 𝐵 ⇄ 𝐴𝐵

𝑘_𝑜𝑓𝑓

avec 𝑘_𝑜𝑛(respectivement 𝑘_𝑜𝑓𝑓) la constante cinétique de réaction vers la droite (respectivement vers la gauche). A l’équilibre, la constante de dissociation est alors définie par :

𝐾_𝐷 = ^{𝑘𝑜𝑓𝑓} 𝑘_𝑜𝑛 ⁼

[𝐴]_𝑒𝑞[𝐵]_𝑒𝑞 [𝐴𝐵]_𝑒𝑞

Plus 𝐾_𝐷 est faible, plus l’affinité est grande entre un ligand et un récepteur. Dans le cas de la streptavidine et de la biotine, il a été mesuré un 𝐾_𝐷 ≈ 10−14mol/L. Cette forte affinité est principalement due à la complémentarité de structure des sites d’interaction des deux molécules, et à l’implication de liaisons hydrogène. Dans le cas du lien entre un anticorps et un antigène, les constantes de dissociation vont typiquement de 𝐾_𝐷≈ 10−6mol/L pour les plus faibles interactions, à 𝐾_𝐷 ≈ 10−9− 10⁻¹¹mol/L pour les plus fortes (source : « abcam »).