Présentation des résultats de notre analyse

As amplificações das regiões de integração presentes nos macrófagos infectados e tratados e linhagens clonais A e G (Argañaraz, 1996), segundo estratégia detalhada na Figura 2 (2a, b, c, d) e hibridação por Southern blot com as sondas: de LINE-1 (M6a1, L1RTa1, L1RTa2 e L1RTs1,) e kDNA (Sk35 e Sk36) geraram fragmentos. Contudo somente os segmentos provenientes do DNA infectado e tratado amplificado com o par de iniciadores SK35/ L1RTa1 apresentaram sinal positivo de hibridação por Southern blot com a sonda interna, SK36 (Figura 9). O resultado sugere a presença de pelo menos uma região conservada de minicírculo de kDNA no produto amplificado. Este mesmo segmento apresentou sinal positivo de hibridação obtido com a sonda do iniciador L1Rta1 indicando a presença de um flanco humano. As bandas positivas obtidas da amplificação, isoladas do gel de agarose e clonadas no vetor PCRII na hospedeira bactéria INVαF’, contrariamente ao esperado, não geraram colônias com insertos positivos para kDNA em Southern blot, em 1000 transformantes analisados.

A mesma estratégia repetida com as amostras de DNA de sangue obtidas de pacientes chagásicos, gentilmente cedidas por Socorro Braga, não geraram sinal de amplificação com os iniciadores SK35, SK36 e L1hinf. Contudo, o par de iniciadores SK36 e M6a1 produziu segmentos positivos com a sonda de minicírculo 122 pb (Figura 10). A clonagem destas bandas em DH5α e CES201, gerou seqüências que não apresentaram características atribuíveis a minicírculos de kDNA ou a LINE-1. Frente ao resultado sugestivo de instabilidade dos insertos clonados, realizou-se nova abordagem para a clonagem das regiões híbridas. Optou-se, portanto pela construção e seleção de bancos genômico enriquecidos da integração, elaborados em diferentes vetores e bactérias hospedeiras.

73 RESULTADOS

Clone A: 638 bp;

1 GTTCGATTGG GGTTGGTGTA ATTAGGAGGA GTTGAGTGGA AGGGAAATGG AGTTGAGTGA AGGATGGAAT

71 GGAATGAGAT GGAATGGAAT GGAATGGAAT GGAATGGAAT GGAATGGAAT GGAATGGAAT GAAAGGAGTG 141 GAGTGGAGTG GGAGTGGAGT GGATTCGAAA TCCTCAATAA AATACTACCA AACCGAATCC AGCAGCAAAT

211 CAAAGCTTAT CCACCATGAT CCAAATGGGC TGCATCCTGG ATGCAGGATG CAGCTGTCAC ATCACATCTC

281 ACATAATCAG CCATTCNNNA TCAAACCCAC GTCCAAAACT CAATGATATG TCAATGATGC AGAAAGCCTT

351 TTGACAAAAT TCAACAACCT TCATTGCCTA AAACTCTCAA TAAATTAGAT ATTGATGGGA TTGGTATCTC

421 AAAATAATAA GAGCTATTTA TGTCAAACCC ACAGCCAATA TCATACTGAA TGGGCTTTTC CTGGAAGCAT

491 TCCCTTTGAA AATCTCAGTT ACCTTTCTTT TGGATATGTG TGTGAGGAAA GAGTACCTAC AAACTACCCT

561 TTTAGTTAAA TGCCATATAC AATAAATATT AATACCTACA GTCCTCATGT TGTATATTAC ACCAACCCCA 631 ATCGAACC

Clone C: 662 bp;

1 GGTTCGATTG GGGTTGGTGT AATTAGGAGG AGTTGAGTGG AAGGGAAATG GAGTTGAGTG AAGGATGGAA

71 TGGAATGAGA TGGAATGGAA TGGAATGGAA TGGAATGGAA TGGAATGGAA TGGAATGGAA TGGAATGGAA 141 AGGGAAGGTA AGGGTGGTGG GAAGTAAGGT GGTGCGCTAA TCCTCAATAA AATACTACCA AACCGATCCA

211 GCAGCAAATC AAAAAGCTTA TCCACCATGA TCCAAACTGG GCTGCATCCC TGGGGTCGAA GGCTGGTTCA

281 CATCACAATC AATCAATCAC ATATCCCAAA CCCACGTCCA AAACTCAATG ATATGTCAAT GATGCAGAAA

351 GCCTTTTGAC AAAATTCAAC AACCTTCATT GCCTAAAACT CTCAATAAAT TAGATATTGA TGGGATTGGT

421 ATCTCAAGGG ATGTATCTCT AATATTAAGA GTCATTTAGT CAAACCCACA GCCAATATCA TACTGAATGG

491 GTNAAAAACC TGGAAGGCAT TCCCTTTGAA AATCTTCAGT TACCTTTCTT TTGGATATGT GTGTGAGGGA

561 AAGAGTACCT ACAAACTACC CTTTTAGTTA AATGCCATAT ACAATAAATA TTAATACCTT ACATGTCCTC

631 ATGTTGTATA TTACACCAAC CCCAATCGAA CC Clone D: 625 bp;

1 GGTTCGATTG GGGTTGGTGT AATATAGTGG AGTTGAGTGG AAGGGAATGG AATGGAATGA GATGGAATGG

71 AATGGAATGG AATGGAATGG AATGGAATGG AATGGAATGG AATGGAAATG GAAGATGGAG TGGAGTGGAG 141 TGGAGTGGAT TGNGAAATNT CAATCTTCCA CTACCAAACC GAATCCAGCA GCAAATCAAA GCTTATCCAC

211 CATGATCCAA ATGGGCTGCA TCCTGGATGC AGGATGCAGC TGTCACATCA CATCTCACAT AATCAGCCAT

281 TCNNNATCAA ACCCACGTCC AAAACTCAAT GATATGTCAA TGATGCAGAA AGCCTTTTGA CAAAATTCAA

351 CAACCTTCAT TGCCTAAAAC TCTCAATAAA TTAGATATTG ATGGGATTGG TATCTCAAAA TAATAAGAGC

421 TATATATGGC ATTATGTCAA CCACAGCAAT TTCATACCTG AATGGCAAAC CTGGAAGCAT CCCTTTGAAA

491 ATCTCAGTAC CTTTCTTTTG GATATGTGTG TGACCAAAGA GTACCTACAA CTACCTTTTA GTTAAAATGC

561 CATATACAAT AAATATTAAT ACCTACAGTC CTCATGTTGT ATATTACACC AACCCCAATC GAACC Clone E: 1067 bp;

1 GTTCGATTGG GGTTGGTGTA TATACAGCCT ACCATGATTC CAAGTGGTAC AAGTATTTTT TTCCAAATGC

71 CTTAAAAAAT ATTTTGGCTT ATTTTTGAAT ATATTCCAGA AAAAAGCAAT GTCACCCAAG TCTCCCAACA

141 TCTCTCTAAA TATATACTTG TGTACGGGTT CAAAATGTAA ATAAAAACCT AAGACTATTT CCTACTTCTG

211 ATGAGAGGCT ATATCTCATG CCTTTGTTTC CCTTAACACC TGGCCAAAAA TGCAGTCCTG GTGCATGGTT

281 AGCATTCATG TAATGTGTGC CAAATTGGAA AAGGAATGAA AAGTGGGAAA GGTCAAAGCT CTGGAAACCC

351 TGGAAGCAAG CCTAGGCAAT CCTTCCTGGA CCCTAAGGAA CAGGTAAAAG ATTTCATGGA CAAAGATACC

421 AAAACCAATT GCAACAAAAA CAAAAATTGA CAGGTGGGAT CTAATTAAAC CTAAAAGCTT GCACACAGCA

491 AAAGAAACTA TCAACAGAGT AAACAGACAA CCTACAGGAA GTGTGAAAAA CATTTACAAA CTATGCATCT

561 GACAAAGGTC TAATATCCAG CATTTATAAG GAACTTAGCA AATTTACAAA AGAAACAACC CCATTAAAAA

631 GTGGACAAAG GACATGAACA GACACCTCTC AAAAGATGAC ATACGTGCAG CCAAGGAGCA TATGAAAAAA

701 ATTCCATATC ACTAATCATT AGAGAATTGC AAATCGAAAC CACAATGAGA TACCATCTCA CGCCAGTCAG

771 AATGGTGATT ATTAAAAAGT CAGGAAACAA TAGATGCTGT GGAGAAATAG ATGAGGTTGT GGAGAAATAC

841 GAAACGGCTT TTACACTGTT GGTGGGAAAT GCAAATTAGT TCAACCATGG TAGAAGACAG TATTGTGATT

911 CCTTAGGGAT ACTGGAACCA AAAATACCAT TTGACCCAGC AATCCCATTA CTAGGTATAT ACTCAAAGGA

981 ATATAAATCA TTGTACTATA AAAGACACAT GCACACCTAG GTTTTATTGC TACATACTAC ATATATTACA

1151 CCAACCCCAA TCGAACC

Figura 7. Seqüências pertencentes ao grupo A: clones A, C, D e E, obtidos por amplificação de macrófagos transfectados com Trypanosoma cruzi, comparadas a seqüências depositadas em banco de dados. Caracteres em vermelho sublinhado, seqüência de bases do iniciador sk36 utilizado na amplificação da extremidade da região conservada de minicírculos de kDNA, região em vermelho não sublinhada bases com correspondência a extremidade da região conservada (Sturm et al.,1989). Caracteres azuis, fragmento putativo de região variável de minicírculos. Em preto, região com identidade indefinida. Amarelo escuro, repetições com identidade entre 84 a 97% com satélite III humano (hssat13 acesos gbIX82942I). Verde, identidade de 70 a 90% com o elemento LINE-1 (HUML1C acesso gbIL19088I): clones A, C e D, similaridade entre as bases 3611 a 3954 do LINE-1; clone E: similaridade na região entre as bases 4895 - 5590. Itálico: desproporção entre purinas e pirimidinas na fita.

74 RESULTADOS

Tc

Tc

Tc

N N N

A

B C

~1,4 kb

Figura 8. DNAs isolados de macrófagos de humanos normais (N) e Trypanosoma cruzi (Tc), digeridos com a enzima EcoR I e hibridados por Southern blot com as sondas isoladas dos clones do grupo A conforme estratégia experimental mostrada na Figura 1. A estringência máxima das lavagens foi de 65 °C/ 20 min com solução 0,1X de SSC e 0,1% SDS. a) Observa-se o sinal positivo de hibridação do fragmento de 280 pb pertencentes à região L1 do clone A (L1A) apenas na linha correspondente ao DNA de macrófago normal; b) Nota-se o sinal de hibridação do segmento de 100 pb pertencente à região satélite do clone A (MAS) no DNA macrófago normal e no DNA de T. cruzi; c) segmento de 89 pb proveniente da região variável de minicírculos de kDNA isolada do Clone A (HVA) mostrando sinal de hibridação positiva somente no DNA de T. cruzi.

75 RESULTADOS

(+)

1 2 3 4 5

c

(-)

(+)

1 2 3 4 5

a

(-) 1 2 3 4 5

b

(-)

~2,0 kb

Figura 9. Segmentos de DNAs obtidos pela amplificação por PCR do DNA de macrófago normal (2), infectado e tratado (3), linhagem subclonal A (4) linhagem subclonal G (5), e de Trypanosoma cruzi (1) com os iniciadores: a) SK 35 e L1RTa1; b) SK 35 e L1RTa2; c) SK 35 e L1RTs1, hibridados por Southern blot com a sonda SK36 de minicírculo de kDNA. (-) controle negativo de amplificação; (+) controles positivos de amplificação e hibridação. Observa-se a presença do sinal positivo de hibridação na linha correspondente a amplificação do DNA de macrófago infectado e tratado com os iniciadores SK35 e LTRa1 e amplificação unidirecional gerada pelo iniciador SK35 nos DNAs de T. cruzi.

Figura 10. Segmentos de DNAs contendo kDNA e DNA humano proveniente de amostras de sangue de pacientes chagásicos. A) Visualização em gel de agarose dos segmentos de DNA amplificados por PCR com os iniciadores SK36 e m6a1: DNAs de pacientes chagásicos (2 a 9) e DNA de T. cruzi (10); controle negativo de amplificação (1), controle positivo de amplificação (12). B) Southern blot do mesmo gel hibridado com a sonda 122 (região conservada que compreende a minicírculo de kDNA), controle negativo de hibridação (12), controle positivo de hibridação (13), marcador de tamanho molecular (1 kb ladder Gibco BRL), estringência de lavagem de acordo com protocolo padrão.

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

B

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

76 RESULTADOS