3. Discussion
3.1 Présence des marqueurs présynaptiques entre les processus neuronaux des neurones
microsphères enrobées in vitro
Nos résultats démontrent que, similairement aux études précédentes (Burry et Lasher, 1978a; Burry et Wood, 1978b; Burry et Wood, 1978c; Burry, 1980; Burry et al, 1986; Peng et al, 1987; Lucido et al, 2009; Lucido et al, 2010; Gopalarkrishnan et al, 2009), les neurones du système nerveux périphérique humain peuvent également former de nouveaux éléments présynaptiques sur des surfaces synthétiques, témoigné par la présence significative de synaptophysine et de VAchT dans les conditions expérimentales pour toutes les durées étudiées (voir chapitre 2:
des propriétés permettant le recrutement des éléments essentiels à la formation de la région présynaptique d’une synapse.
La présence moindre de la synaptophysine dans les conditions DND par rapport aux conditions PDL contredit des résultats précédents dans une étude de nos collaborateurs (Al Alwan et al, données internes). En effet, alors que les deux substances étaient comparable à 1, 3 et 7 jours, le DND était significativement inférieure en terme de fluorescence pour la synaptophysine à 5 jours (p<0.05) et à 9 jours (p<0.0001). Nous suggérons quelques explications possibles qui pourraient expliquer cette différence. Il est possible que, malgré que le dendrimère soit appréciée par les neurones du système nerveux central, cette substance aurait un effet différent avec les neurones du système nerveux périphérique. La présence moins importante de la synaptophysine indique possiblement une moins bonne stabilité de certaines nouvelles connexions formées en réponse à la présence de dendrimère. La provenance des cellules, soit humaine dans cette étude comparativement à celle du rat dans l’étude de Al Alwan et al (données internes), pourrait également être un facteur expliquant cette différence. La confirmation de cette hypothèse demandera des études plus poussées sur les différences entre les modèles d’étude murins et humains en réalisant, par exemple, une étude similaire avec des neurones moteurs de rat. Il en demeure que la présence de synaptophysine autour des microsphères de DND reste significativement supérieure au contrôle pour toutes les durées d’incubation étudiées. Idéalement, la présence de synaptophysine et de VAchT devrait être étudiée au-delà de 9 jours d’incubation pour confirmer la pertinence des substances étudiées pour les neurones moteurs humains. Cependant, il est difficile d’augmenter les temps d’incubation avec les microsphères au-delà de la durée maximale dans cette étude, puisque la viabilité des cellules chuterait de façon importante. Ce déclin est observable par la morphologie des motoneurones humains: les noyaux de ces derniers auraient alors tendance à s’agglutiner ensemble et former des câbles avec leurs axones, soit des signes de détresse cellulaire. Ils finiront par la suite par décoller du plateau de culture, témoignant ainsi de la mort cellulaire. Ainsi, il est difficile d’évaluer si la présence des marqueurs présynaptiques continue à diminuer avec l’augmentation de la durée d’incubation ou se stabilise et, dans le cas échéant, si cette dernière demeurera significativement plus élevée que dans la condition contrôle.
Dans un organisme vivant, les neurones moteurs rejoignent leur cible musculaire par la plaque motrice, une région sans myéline où l’axone se divise en plusieurs branches (Kandel et al, 2013). À l’extrémité, des boutons synaptiques se positionnent sur une région de la fibre musculaire présentant des plis du sarcolemme (junctional folds) avec les récepteurs d’acétylcholine. La zone active délimitant la région où se retrouve une accumulation de vésicules présynaptiques contenant l’acétylcholine est indicatrice de la maturité de la synapse (Peng et al, 1987). Nos expériences in vitro visent à explorer cette connexion neuro-musculaire avec une cible post- synaptique synthétique, représentée par les microsphères enrobées d’une substance synaptogénique. Nos résultats suggèrent que le recouvrement des microsphères avec la PDL et le DND entraîne une reconnaissance de la surface synthétique comme l’équivalent des plis d’un sarcolemme d’une fibre musculaire. Ainsi, nous observons in vitro une accumulation des protéines présynaptiques synaptophysine et VAchT aux sites de contact entre les processus neuronaux des neurones moteurs et la surface des microsphères enrobées des substances expérimentales de notre étude. En concordance avec les observations de Peng et al (1987) avec le SV48 dans le système nerveux périphérique de la grenouille, les images démontrent la capacité d’un processus neuronal de former des éléments présynaptiques avec plusieurs microsphères qui rentrent en contact avec ce dernier.
Les images indiquent la présence plus importante de synaptophysine et de VAchT sur la majorité mais pas la totalité des microsphères expérimentales analysées. Ceci pourrait être expliqué par la présence d’éléments cellulaires nécessaires à la formation d’un nouveau bouton synaptique sélectivement à certains endroits dans les processus neuronaux (Burry, 1980). Il serait également possible que les microsphères concernées seraient en contact avec des cellules autres que les neurones moteurs, vu que la pureté des cellules n’est pas absolue (Du et al, 2015). Il est peu probable qu’un mauvais protocole d’enrobage des microsphères ou de manipulation a créé une hétérogénéité au sein des microsphères, puisque cette même méthode a été employée avec succès dans une étude similaire avec des neurones corticaux du rat (Al Alwan et al, données internes). De plus, vu les temps d’incubation et la stabilité reconnue des substances expérimentales utilisées, il est aussi peu probable que les enrobages soient dégradées par les activités cellulaires enzymatiques ou oxidatives. Ainsi, il est possible que certains facteurs non-
Un défi des expériences in vitro était l’adhérence des microsphères contrôle au plateau de culture. En effet, similairement à l’étude de Lucido et al (2009), les microsphères non-enrobées (contrôle) étaient beaucoup moins adhérents que les microsphères enrobées, expliquant ainsi leur faible densité au sein des cultures. En effet, les manipulations, particulièrement l’aspiration et l’ajout de liquide, contribuaient à déloger les microsphères non-enrobées de la lamelle de culture. Parmi les restants, plusieurs se retrouvent accolés sur les corps cellulaires et ont été exclus de l’analyse vu qu’ils ne sont pas représentatifs du phénomène à observer. Ceci explique la disparité en termes de nombre de microsphères analysées dans les conditions contrôles par rapport aux conditions expérimentales (Voir chapitre 2, figure 4 et 6). Le nombre de microsphères analysées par plateau de culture a été maximisé mais n’atteint pas nécessairement 25 par série de culture, ce qui expliquerait les disparités entre du nombre d’analyses (n) des différentes conditions. Cependant, nous observons tout de même des différences significatives avec des n plus petites, ce qui renforce la forte signifiance de nos résultats.