Préparation des suspensions bactériennes

Les expérimentations présentées dans ce travail reposent sur la filtration de bactéries (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, …). La préparation et l’utilisation de ces suspensions bactériennes (de la matière vivante potentiellement dangereuse et sujette à une grande variabilité) exigent un protocole expérimental précis et soigné.

II.1.1. Choix des bactéries

Durant les séries de manipulations, le comportement de plusieurs bactéries a été étudié :

• Escherichia coli CIP 54127 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France). E. coli nous a servi de bactérie de référence car elle est le témoin de contamination fécale et par-là même systématiquement recherchée et dénombrée lors de la potabilisation de l’eau.

• Pseudomonas aeruginosa CIP 82118 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France).

• Deux isolats cliniques de Pseudomonas aeruginosa provenant d’un sujet atteint de mucoviscidose et caractérisé mucoïde : 7844 M ainsi que

58 son révertant non muqueux 7844 S (Laboratoire de Bactériologie – CHU Rangueil – Toulouse).

Les différentes souches de P. aeruginosa nous ont permis d’étudier l’influence de la sécrétion d’EPS et d’élargir nos résultats à d’autres sortes de bactéries de type Gram négatif.

• Staphylococcus aureus CIP 4.83 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France).

• Enterrococcus hirae CIP 5855 (Collection de l’Institut Pasteur, Paris, France).

Les deux souches bactériennes citées précédemment sont de type Gram positif. Elles vont permettre dans le chapitre Chapitre V de regarder si les résultats obtenus avec des bactéries Gram – sont identiques à ceux obtenus avec des bactéries de type Gram +.

II.1.2. Conservation des souches

Les souches bactériennes sont conservées à -80°C dans un bouillon Eugon (Biomérieux) additionné de 5% de glycérol. Après décongélation les souches sont ensemencées sur des géloses trypcase soja en pente (Biomérieux). Apres 24h de croissance à 37 °C elles sont conservées à 4 ± 2°C. Avant chaque manipulation les souches mères sont repiquées sur des géloses trypcase soja, en boite de Petri, et incubées pendant 24h à 37°C (Norme NF EN 12353).

Les caractères morphologiques macroscopiques et microscopiques des cultures et des colonies, c'est-à-dire la forme des colonies, la pureté, la coloration de Gram, la mobilité bactérienne, sont systématiquement vérifiés avant la mise en suspension.

59 II.1.3. Coloration de Gram

La coloration de Gram est basée sur l’aptitude de la paroi bactérienne à permettre le transfert de l’alcool. Pour vérifier cela, un échantillon de suspension bactérienne est prélevé, coloré par du cristal violet (ou violet de gentiane) qui est fixé par du lugol (solution d’iodure de potassium) et rincé à l’alcool, les bactéries de type Gram – sont décolorées. Le prélèvement est ensuite recouvert de colorant rose (Fuchsine) afin de recolorer les bactéries de type Gram -. Les différentes étapes de la coloration sont décrites sur la Figure II-1.

Gram - Gram + Coloration au cristal violet Fixation au lugol Décoloration à l’alcool Recoloration à la fuschine

Figure II-1 : Etapes de la coloration Gram.

• Si la bactérie est colorée en violet sa paroi est imperméable au solvant. Il s’agit d’une bactérie de type Gram +.

• Si elle est colorée en rose il s’agit d’une bactérie de type Gram –.

II.1.4. Examen de l’état frais

L’examen de l’état frais permet de visualiser la mobilité, le mode de regroupement ainsi que la forme des bactéries. Pour cela à l’aide d’une oëse2, des bactéries sont

60 prélevées et étalées sur une lame de verre avec une goutte d’eau physiologique, la goutte est ensuite recouverte d’une lamelle. Avec un microscope optique, objectif X40, la morphologie des bactéries (bacilles, coques…) ainsi que leur mobilité sont observées et décrites afin de s’assurer qu’elles correspondent aux caractéristiques des dites bactéries.

II.1.5. Mise en suspension

Les bactéries sont mises en suspension dans les solutions stériles. Pour cela elles sont prélevées de la boite de Petri à l’aide d’une oëse et dispersées dans le milieu. Leur concentration est déterminée par mesure de la densité optique à 640 nm au spectromètre UV (UviLight XTD 5, Secoman). Une concentration de 1 à 3.108

(Unités Formant Colonie)/mL correspond à une transmission de 70% et de 77% respectivement pour Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa.

Toutes les manipulations sont effectuées sous un PSM (Poste de Sécurité Microbiologique) type II respectant la norme NF EN 12469.

II.1.5.1. Milieux de suspension utilisés

Les suspensions bactériennes ont été préparées dans plusieurs milieux. En premier lieu, une solution aqueuse de NaCl à 9 g/L (eau physiologique), correspondant à 155 mM est utilisée.

L’eau physiologique est un milieu isotonique, il permet aux bactéries de ne pas gonfler, ni éclater grâce à la régulation de la pression osmotique interne.

Les autres milieux de suspension utilisés sont préparés de façon à être dans des conditions isotoniques c'est-à-dire des solutions présentant une pression

61 osmotique identique. Afin de déterminer dans chaque cas la concentration en sel correspondante, l’équation de Van’t Hoff ci-dessous est utilisée :

(II-1)

Avec i : le nombre d’ions dissociés ; C : la concentration molaire volumique ; R : la constante des gaz parfait ; T : la température en Kelvin

Deux autres solutions permettant de tester l’effet de l’ion calcium sur le comportement bactérien avec des conditions isotoniques équivalentes (Π = 7,58 atm pour une température de 25 °C) ont été ainsi réalisées :

• une solution aqueuse de CaCl2 à 103 mM

• une solution aqueuse contenant un mélange NaCl+CaCl2 avec

respectivement 78 mM et 51,5 mM

Avant toutes manipulations, les différents milieux sont stérilisés par autoclavage (10 minutes à 121°C).

II.1.5.2. Contrôle de dénombrement et de viabilité

Des contrôles de dénombrement ainsi que de viabilité sont effectués dans chaque milieu de suspension à t₀ mais également à t = 2h, qui correspond au temps d’une filtration. Pour t0 et à t = 2h, le protocole de dénombrement par inclusion est

identique.

Les bactéries sont mises en suspension dans les différentes solutions, la concentration est ajustée aux alentours de 1 à 3.108 _{UFC/mL par spectrométrie. La}

procédure suivie est la suivante :

• 5 dilutions successives de raison 10 sont effectuées afin d’obtenir des suspensions comprenant entre 100 et 300 UFC/mL.

62 • 1 mL de ces suspensions est inoculé dans des boites de Petri puis

recouvert de gélose trypcase soja et incubé pendant 24h à 37 °C. • Les UFC sont ensuite comptées afin de connaitre le nombre exact. Ce dénombrement est effectué deux fois par suspension, la moyenne du nombre de bactéries comptées donne la concentration bactérienne des suspensions.

Pour vérifier la viabilité bactérienne, l’opération de dénombrement est effectuée à t0 et à t = 2h. La différence correspond au nombre de bactéries qui sont

mortes ou non cultivables dans les 2h de suspension.