3.3 2.1 Préparation des globules rouges humains.

Une suspension du sang humain frais entier a été collectée et mélangé avec un volume égal de solution (2% de dextrose, citrate de sodium à 0,8%, 0,05% d'acide citrique et du chlorure de sodium à 0,42%). Le sang a été centrifugé à 3000 rpm pendant 10 min, les cellules ont été

lavé trois fois avec un tampon PBS (pH 7,4). Le volume du sang a été mesurée et reconstitué en tant que 10% v / v de suspension avec le tampon PBS (Oyedapo et al., 2010).

II.3.3.3. Hémolyse induite par hypotonicité

Le mélange d'essai contient du tampon phosphate de 1mL (pH 7,4), 2 mL hypo saline (0,36%), 0,5 mL de suspension du sang (10% v / v), 0,5 mL d'extraits de plantes ou médicament standard diclofenac sodique de diverses concentrations (50, 100, 250, 500, 1000 µg / mL) et le contrôle positif (le triton X100 1% au lieu de solution hypo-saline pour produire 100% d'hémolyse ) a été incubé à 37 ° C pendant 30 min et centrifugé respectivement. La teneur en hémoglobine dans le surnageant a été estimée à l'aide de spectrophotomètre à 560 nm (Sumathi et Anuradha, 2016).

Le pourcentage d'hémolyse des hematies peut être calculé comme suit:

% Hémolyse = (densité optique de test échantillon / densité optique de contrôle) X 100

Le pourcentage de stabilisation de membrane peut être calculée comme suit: % Protection = 100 - [(densité optique de test échantillon / densité optique de contrôle) X

100].

II.3.3.4. Hémolyse induite par chaleur

3,5mL de tampon PBS (pH 7,4) contenant des extraits et le dilofenac sodique comme standard à différents concentrations sont mises dans de tubes de centrifugation. Une suspension du sang à 10% (500 µl) a été ajoutée à chaque tube et on mélange doucement par inversion. Un blanc de chaque concentration des extraits est réalisé sans ajout du sang. Un témoin négatif sans extraits (0% hémolyse), témoin positif d’hémolyse totale sont aussi réalisé avec du triton X100 1% à la place des extraits, les tubes ont été mis en incubation à 56oC pendant 30 min dans un bain d'eau. Aprés refroidissent, le mélange réactionnel a été centrifugé pendant 5 min à 3000g et l'absorbance du surnageant a été mesurée à 560 nm (Akinwunmi et al., 2015). Le pourcentage d'inhibition ou d'accélération de l'hémolyse dans les essais et a été calculée selon l'équation:

% Hémolyse = (densité optique de test échantillon / densité optique de contrôle) X 100 Le pourcentage de stabilisation de membrane peut être calculée comme suit: % Protection = 100 - [(densité optique de test échantillon testé / densité optique de contrôle)

II.3.3.5. Méthodes de dénaturation de l'albumine

Le mélange réactionnel (0,5mL) est constitué de 50µl d'extrait d'essai à différente concentration (50, 100, 250, 500, 1000 and 2000 μg/mL) et 0,45 mL de 5% de solution aqueuse de la fraction d'albumine bovine, le pH du mélange réactionnel est ajusté à 6.3 à l'aide de HCl.

Les extraits d'échantillons ont été incubés à 37 ° C pendant 20 min, puis chauffé à 56 ° C

pendant 20 min, après refroidissement, 2.5 mL de tampon PBS (pH 6,3) est additionné. La turbidité des échantillons a été mesurée par spectrophotométrie à 660 nm (Anyasor et al.,

2015). L'expérience a été réalisée en trois exemplaires.

Le pourcentage d'inhibition de la dénaturation des protéines a été calculé comme suit: % inhibition = [{Abs contrôle - Abs échantillon} / Abs contrôle] × 100 (Jayaprakasam et

Ravi, 2012).

II.3.4. Evaluation de la toxicité et de l’activité anti-inflammatoire in vivo II.3.4.1. Introduction

Helichrysum stoechas est utilisé dans la médecine traditionnelle par la population européenne

et africaine pour ces propriétés cicatrisante et pour soulager la douleur (colique, rénale et dents). Il a été rapporté que Helichrysum stoechas possède des propriétés antibactériennes (Sobhy et EL-Feky, 2007), antioxydants (Carini et al., 2004) et anti inflammatoires (Recio et

al.,1991).

L’objectif de cette étude est de confirmer l’activité anti inflammatoires de l’extrait ethanolique et d’évaluer sa toxicité per os .

II.3.4.2. Le test de toxicité

La méthode de Kerber implique l'administration de différentes doses de substance d'essai à divers groupes de quatre souris chacun (28-40g) élevées dans du laboratoire de l’animalerie. Cette méthode implique le dosage de toxicité des animaux avec la substance d'essai dans un intervalle de temps de 48 heures. Après l'administration de la première dose, la suivante est déterminée par le résultat de la dose subséquente administrée. Si l'animal survit à la dose suivante, la dose est augmentée, mais lorsque la mortalité est enregistrée à la dose suivante, elle est diminuée. L'ajustement de la dose soit vers le haut, soit vers le bas est un facteur

constant. Les essais sont terminés lorsque la limite supérieure (2000-5000 mg / kg) a été atteinte sans mortalité ou lorsque la DL50 a été établie à partir de l'essai.(Chinedu et al., 2013) (Maheshwari et Shaikh Nusrat, 2016).

Les souris sont mises à jeun pendant 24 h. Le premier groupe ou groupe-témoin reçoit de l’eau distillée tandis que les groupes 2 à 5 reçoivent différentes dose unique de l’extrait éthanolique de H.stoechas (1g/kg, 2g/kg, 4g/kg, 5g/kg, 6g/kg) dissous dans 1mL d’eau distillée, à l’aide d’une sonde de gavage. L’évolution des comportements tels que l’agitation, la fatigue, la diarrhée, le grattage, les mouvements de la queue, la perte des poils et la mortalité des animaux est suivie pendant 2 jours. Tous les animaux reçoivent normalement de l’eau et les aliments toute la durée de l’expérimentation. La moyenne d'intervalle d'un certain nombre de décès enregistrés dans chaque groupe et la différence de dose entre les groupes sont des paramètres clés de cette méthode. (Maheshwari et Shaikh Nusrat, 2016). La DL50 est calculée en utilisant la méthode arithmétique de Karber (1931) (In AL-Jubory, 2013), selon l’équation suivante:

DL50 = Dm – Ʃ (z x d) / n

Où, DL50 = dose létale médiane qui tue 50% des animaux.

Dm = La dose la plus faible requise pour tuer 100%

z = la moyenne de la somme des morts à deux doses consécutives.

d = la différence entre deux doses consécutives.

n = nombre d’animaux utilisés par lot

II.3.4.3. Protocole expérimental de l’activité anti-inflammatoire in vivo

Pour mettre en évidence l’activité anti-inflammatoire de l’extrait d’une plante médicinale, un modèle expérimental d’inflammation aigue de la patte de la souris induit par l’Agar-Agar a été sélectionné (Iwueke et al., 2006)

II.3.4.3.1. Principe : L’injection de l’agar-agar sous l’aponévrose plantaire de la patte

postérieure de la souris entraîne l’apparition d’un œdème de la région métatarsienne. L’intensité de cet œdème, qui atteint son maximum de développement en 6 heures, est évaluée grâce à l’augmentation du volume de la patte (par rapport au volume initial).

L’administration préventive par voie orale d’un produit anti-inflammatoire réduit de façon significative le développement de l’œdème

.