Préparation des constructions plasmidiques

Plusieurs polymérases ont été utilisées suivant la séquence à amplifier et le niveau de fidélité d’amplification voulu (TaqPolymérase et Phusion Polymérase, Tableau 7). Le profil des produits de PCR est vérifié après une migration de 30 à 45 min sur gel d’agarose 1 % avec du BET à 100 mV. Le marqueur de taille utilisé est le Smart Ladder MW1700-02 marquant de 200 à 10.000 pb (Eurogentec). Les bandes d’intérêts ou les produits de PCR avant migration sont extraits avec le kit Gel and PCR Clean Up (Macherey Nagel). Après élution, les ADN d’intérêts sont dosés au nanodrop (Nanodrop One, Ozyme) et conservés dans la glace ou à -20°C avant utilisation.

1. 5’ et 3’ RACE PCR nichées

Les PCR nichées se font en deux réactions de PCR successives qui permettent d’augmenter la spécificité d’une réaction. Les réactions de RACE-PCR sont réalisées avec des Taq polymérases provenant de deux fournisseurs différents : TaqDNA polymérase (Euromedex, MgCl2 2 mM, dNTP 0,25 mM, amorces 0,4 µM, TaqDNA polymérase et tampon 1X) et GoTaq (GoTaq G2 Hot Start Green Master Mix, Promega, MgCl2 2 mM, dNTP 0,2 mM, amorces 0,5 µM, GoTaq polymérase et tampon 1X, pH 8,5). Les deux polymérases rajoutent une adénine nécessaire pour le clonage des produits de PCR dans les vecteurs pGEM-T (Annexe 1) ou pCR-4 (Annexe 2). Pour les séquences des sous-unités codantes les GluCls et les GABACls de Parascaris sp. et de P. humanus humanus, les parties en 5’ et en 3’ n’ont pas pu être identifiés à la suite de recherche bioinformatiques dans les bases de données génomiques et transcriptomiques. Par conséquent, des RACE PCR nichées ont été réalisées pour identifier les extrémités manquantes à l’aide de deux couples d’amorces. Pour les 5’ RACE PCR, le premier couple est défini avec l’amorce antisens dans une région spécifique de la séquence codante tandis que l’amorce sens est définie soit dans la séquence SL1 (Splice Leader 1 qui est présente en 5’ avant le codon d’initiation de la traduction de nombreux gènes chez les nématodes) (293) pour Parascaris sp. soit dans l’oligoARN rajouté lors de la rétrotranscription des ARN pour P. humanus humanus. De même, pour les 3’RACE PCR, le premier couple d’amorces est défini avec une amorce sens dans la région codante spécifique du gène d’intérêt et une amorce antisens dans la queue polyA (polyadénylation) pour Parascaris sp. ou dans la séquence rajoutée après la queue polyA pour P. humanus humanus. Après la première réaction de PCR, le produit du 1er tour est dilué à 1/70 pour servir de matrice au 2e tour de PCR. Un deuxième couple d’amorce plus interne est défini dans les mêmes régions. Le protocole des PCR est indiqué dans le Tableau 7.

Phusion polymérase Taq polymérase

Température Temps ^{Nombre de}

cycles ^{Température Temps}

Nombre de cycles

Dénaturation initiale 98°C 1 min 94°C 1 min

Dénaturation 98°C 30 s

45 cycles

94°C 30 s

45 cycles

2. Amplification des séquences codantes des sous-unités

Les séquences codantes complètes des sous-unités sont amplifiées en PCR nichées avec la Phusion High Fidelity Polymerase (New England BioLabs) qui présente un très faible taux d’erreurs lors de la réplication (1 µL d’ADNc, tampon GC 1X (contenant MgCl2 1,5 mM), dNTPs 0,2 mM chacun, amorces 0,5 µM, Phusion polymérase 0,02 U/µL, eau qsp 20 µL). Un premier couple d’amorce est défini dans les 5’UTR et 3’UTR (untranslated regions) et un deuxième couple plus interne est défini pour encadrer le codon d’initiation de la traduction et le codon stop. De plus, le 2e couple d’amorce contient une quinzaine de nucléotides supplémentaires en 5’ correspondant aux régions flanquantes des sites d’intégration XhoI et ApaI dans le plasmide de transcription pTB207 (Annexe 3). Les sites d’intégration permettent une insertion orientée du produit de PCR dans le vecteur.

3. Amplification de promoteur

En se basant sur les données génomiques de Parascaris sp. disponibles dans GenBank, 3 à 5 kb de la région en amont du codon d’initiation de la traduction sont amplifiées et considérées comme étant la région promotrice de la sous-unités glc-5. L’amplification du promoteur se fait en PCR nichées avec deux couples d’amorces dont le 2e

contient dans la partie 3’ les nucléotides nécessaires à l’insertion orientée du produit de PCR dans le vecteur pPD95.75 (Annexe 4). Dans ces conditions de clonage, le promoteur des sous-unités dirigera l’expression de la GFP contenue dans le plasmide pPD95.75.

4. Clonage dans pGEM-T/pCR-4

Les produits de PCR des 5’ et 3’ RACE-PCR sont clonés dans les vecteurs pGEM-T (Promega, Annexe 1) et pCR-4 (Invitrogen, Annexe 2). Ces vecteurs contiennent une cassette de résistance à l’ampicilline pour la sélection des colonies recombinantes sur gélose.

Les produits de PCR des 5’ et 3’ RACE-PCR de Parascaris sp. sont clonés dans le vecteurs pGEM-T (Promega, Annexe 1) avec le kit Rapid DNA Ligation kit (Thermo ScientificTM). Pour les séquences de P. humanus

humanus, le clonage est réalisé dans le vecteur pCR-4 (Invitrogen, Annexe 2) avec le kit TOPA TA CloningTM kit for Sequencing (Invitrogen). Après la réaction, le mix est placé dans la glace pour transformation.

5. Clonage dans pTB207

Les clonages des séquences codantes complètes des sous-unités dans le vecteur de transcription pTB207 se font avec le kit In-Fusion HD cloning kit (Takara Bio, Japon). Ce vecteur est composé du promoteur T7, qui contrôle l’expression de la séquence qui sera insérée, et du 3’UTR de la β-globine de xénope nécessaire à la bonne reconnaissance des ARNc par le système de traduction de l’œuf de xénope. De plus, ce vecteur contient une cassette de résistance à l’ampicilline pour la sélection des colonies recombinantes sur gélose (Annexe 3). Les quantités d’inserts et de vecteurs à mélanger sont calculées grâce à l’outil In-Fusion molar ratio calculator (Takara Bio) pour avoir un ratio insert/vecteur optimal de 2 pour 1. Après la réaction, le mix est placé dans la glace pour transformation.

6. Transformation et criblage de colonies

Les bactéries utilisées sont des Escherichia coli DG1 thermocopétentes (Eurogentec) conservées à -80°C. Les bactéries sont décongelées dans la glace. Les transformations sont réalisées par un choc thermique classique et les bactéries sont étalées sur des géloses de LB contenant de l’ampicilline à 100 µg/mL avant d’être laissées à l’étuve à 37°C toute une nuit.

Les colonies sont repiquées et criblées par PCR avec la Taq polymérase (Euromedex, MgCl2 2 mM, dNTP 0,25 mM, amorces 0,4 µM, Taq polymérase et tampon 1X) ou avec la GoTaq (GoTaq G2 Hot Start Green Master Mix, Promega, MgCl2 2 mM, dNTP 0,2 mM, amorces 0,5 µM, GoTaq polymérase et tampon 1X, pH 8,5). Les amorces utilisées encadrent la zone d’insertion de l’insert (amorces M13F et M13R pour pGEMT (Annexe 1) et pCR4 (Annexe 2), T7P et 207R pour pTB207 (Annexe 3) ou amorces spécifiques de l’insert pour les vecteurs pPD95.75 (Annexe 4) et pPD96.52). Le profil de PCR est analysé après migration sur un gel d’agarose 1%. Les clones positifs sont mis en incubation dans du milieu LB contenant de l’ampicilline (100 µg/mL) toute une nuit.

7. Extraction de plasmides

Les plasmides sont extraits sur 3 mL de culture bactérienne pour les minipreps ou sur 25-50 mL de culture pour les maxiprep avec le kit EZNA Plasmid DNA Mini kit I (Omega Bio-tek, USA). Les constructions sont dosées au nanodrop (Nanodrop One, Ozyme) puis envoyées au séquençage (Eurofins Genomics) pour vérification de la séquence.

Les clones bactériens possédant la bonne séquence d’intérêt sont conservés sous forme de glycérol stocks en mélangeant 850 µL de culture bactérienne avec 150 µL de glycérol dans des cryotubes (NuncTM CryotubeTM Vials). Les clones sont conservés à -20°C.

D. Linéarisation des plasmides de transcription

Les constructions dans le vecteur pTB207 doivent être linéarisées pour ensuite réaliser la synthèse des ARNc. Les enzymes utilisables pour la linéarisation du vecteur pTB207 sont PaeI (SphI), MscI (MlsI), PacI ou NheI. Toutes permettent de linéariser le plasmide en gardant le promoteur T7 et le 3’UTR de la β-globine de xénope encadrant la séquence codante d’intérêt. Lorsque c’est possible, une combinaison de deux enzymes est utilisée plutôt qu’une pour augmenter le taux de succès de la réaction. Le mix contenant 6 µg de plasmides, du tampon Fast Digest 1X (Thermofisher), 5 µL d’enzymes de restriction dans un volume final complété avec de l’eau à 60 µL, est placé en incubation 30 min-1 h à 37°C. Les plasmides digérés sont purifiés avec le kit Gel and PCR Clean up (Macherey Nagel) et élués avec 21 µL d’eau avant d’être dosés au nanodrop. La qualité de la digestion est vérifiée en faisant migrer 300 ng de plasmides linéarisés sur gel d’agarose 0,8 %.

E. Transcription d’ARNc in vitro

Les plasmides linéarisés permettent de synthétiser les ARN complémentaires (ARNc) des séquences correspondantes. La transcription in vitro se fait avec le kit mMESSAGE mMACHINE® T7 (AmbionTM) en suivant les recommandations du fournisseur. Le culot d’ARNc est repris avec 20 µL d’eau sans RNase avant d’être dosé au nanodrop. La taille et l’intégrité des ARNc sont vérifiées par migration de 300-1000 ng d’ARNc sur gel d’agarose 1%. Les ARNc sont ensuite préparés seuls ou en combinaison à la concentration souhaitée (800-1000 ng/µL pour les sous-unités seules et 400-800 ng/µL pour chaque sous-unité en combinaison) et conservés à -20°C jusqu’à utilisation.

VI. Electrophysiologie