Préparation des échantillons

1. Préparation des témoins

a) Cas de C1 et C2

(1) Selon le protocole de la Pharmacopée Européenne [14] Une solution stock d’acide 3-O-acétyl-11-céto-β-boswellique (C1) est préparée à la concentration de 14,80 µg/mL à partir d’environ exactement 0,740 mg de poudre, pesé sur une balance de précision puis dissous dans 50 mL de méthanol de qualité HPLC. La solution est finalement diluée au demi dans la phase mobile constituée d’un mélange ACN/Eau (84/16 V : V), donnant une concentration finale de 7,40 µg/mL.

Une solution stock d’acide 11-céto-β-boswellique (C2) est préparée à la concentration de 7 µg/mL à partir d’environ exactement 0,350 mg de poudre, pesé sur une balance de précision puis dissous dans 50 mL de méthanol de qualité HPLC. La solution est finalement diluée au demi dans la phase mobile constituée d’un mélange ACN/Eau (84/16 V : V), donnant une concentration finale de 3,50 µg/mL.

Une solution fille contenant les deux témoins est préparée par mélange de deux volumes identiques des solutions stocks de C1 et C2, donnant respectivement des concentrations finales de 3,70 µg/mL et 1,75 µg/mL. Cette solution est donc diluée au demi par rapport aux solutions stocks.

Après homogénéisation, toutes les solutions sont filtrées sur une membrane de porosité 0,45 µm (membrane en nylon de diamètre 13 mm) avant injection en UHPLC-UV. Ces solutions sont conservées à une température de 4°C.

(2) Optimisation de la préparation du témoin C1

Pour optimiser la résolution des pics en UHPLC-UV, trois nouvelles solutions stocks de C1 sont préparées à partir de trois solvants différents. Environ exactement 0,250 mg de poudre de C1 est pesé sur une balance de précision, puis mis en solution dans environ exactement 20 mL de méthanol de qualité HPLC, formant ainsi une solution stock de concentration 12,50 µg/mL. La même masse de poudre de C1 est à nouveau pesée sur une balance de précision, puis dissoute dans environ exactement 20 m d’éthanol 33 % (V : V) de qualité HPLC. La même masse de poudre est pesée puis dissoute dans 20 m d’un mélange d’ACN et d’eau tamponnée avec de l’acide phosphorique à 0,1 % (84/16/0,1 V : V : V), tous de qualité HPLC. Cette dernière solution correspond à la phase mobile utilisée dans les analyses chromatographiques.

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b) Cas de B1

(1) Selon le protocole de la publication de 2014 [96]

Une solution stock de l’acide β-boswellique (B1) est préparée à la concentration de 13 µg/mL à partir d’environ exactement 0,260 mg de poudre, pesé sur une balance de précision, puis dissous dans un mélange Méthanol/Eau (30/70 V : V) de qualité HPLC.

Après homogénéisation, la solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,45 µm (membrane en nylon de diamètre 13 mm) avant injection en UHPLC-UV. Elle est conservée à une température de 4°C.

(2) Optimisation de la préparation du témoin B1

Une solution stock de l’acide β-boswellique (B1) est préparée à la concentration de 13 µg/mL à partir d’environ exactement 0,260 mg de poudre, pesé sur une balance de précision puis mis en solution dans 20 mL de méthanol de qualité HPLC.

Une solution stock de l’acide β-boswellique (B1) est préparée à la concentration de 13 µg/mL à partir d’environ exactement 0,260 mg de poudre, pesé sur une balance de précision et dissous dans 20 mL d‘ACN de qualité HPLC.

Une solution stock de l’acide β-boswellique (B1) est préparée à la concentration de 13 µg/mL à partir d’environ exactement 0,260 mg de poudre, pesé sur une balance de précision, mis en solution dans 20 mL dans un mélange Ethanol/Eau (33/67 V : V) de qualité HPLC.

Après homogénéisation, les solutions sont filtrées sur une membrane de porosité 0,45 µm (membrane en nylon de diamètre 13 mm) avant injection en UHPLC-UV. Elles sont conservées à une température de 4°C.

(3) Evaluation de la perte à l’évaporation/reprise

Pour évaluer la perte de B1 lors de la technique de chauffage à reflux, exactement 10,0 mL de la solution stock de B1 sont prélevés à l’aide d’une pipette jaugée puis introduits dans le ballon. a solution est chauffée à reflux pendant 10 min avec des conditions opératoires précises : le ballon doit être immergé dans un bain marie à une température de 90°C, avec une vitesse de rotation de 90 tours/min. La solution est évaporée jusqu’à obtenir un extrait d’une masse finale d’environ exactement 0,92 g. Environ 8 mL de méthanol sont ajoutés afin de permettre une meilleure reprise de l’extrait qui est transféré dans une fiole jaugée de 10,0 mL. La fiole est complétée avec du méthanol jusqu’au trait de jauge. a solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,45 µm, avant injection en UHPLC-UV.

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2. Préparation de la matière première : encens

Le protocole de la Pharmacopée Européenne et celui de l’AMM sont utilisés pour C1, C2 et B1.

a) Selon le protocole de la Pharmacopée Européenne

Les échantillons solides d’exsudat sont broyés de manière homogène dans un mortier avec un pilon, formant une poudre fine de couleur jaunâtre. Environ exactement 1,0 g d’encens pulvérisé est pesé à l’aide d’une balance de précision, puis dissous dans 90 mL de méthanol. Pour faciliter la dissolution, le mélange est traité dans un bain aux ultrasons à la fréquence de 40 kHz pendant 10 min en agitant à 3 ou 4 reprises. ’ensemble est complété à 100 m puis décanté pendant 20 min. e surnageant est dilué au 1/50ème dans du méthanol puis filtré sur une membrane de porosité 0,45 µm, avant injection en UHPLC-UV.

b) Selon l’AMM du CCAP®

Pour s’approcher du procédé de fabrication du CCAP®, les conditions de l’AMM sont respectées. Une prise d’essai en grammes d’encens broyés est mélangée dans de l’éthanol 33 % (V : V). ’échantillon est mélangé plusieurs fois par retournement et conditionné dans des flacons ambrés. La solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,45 µm, avant injection en UHPLC-UV.

c) Cas de C1 : étude de la perte à la filtration

a solution d’encens préparée selon le protocole de la Pharmacopée Européenne est filtrée avant une première injection en UHPLC-UV. La solution est de nouveau filtrée puis réinjectée dans le système chromatographique. Cette dernière étape est réitérée une troisième fois.

3. Préparation des échantillons de CCAP®

Plusieurs lots de CCAP® sont utilisés dans cette étude : CH 164 et CH 166. Ils ont été fabriqués respectivement en août et décembre 2016 à partir du même lot d’encens.

a) Pur

Environ exactement 2 g de CCAP® (lots CH 164 et CH 166) sont prélevés et filtrés sur une membrane de porosité 0,45 µm puis injectés en UHPLC-UV.

b) Cas de C1 et C2 : CCAP® concentré

Environ exactement 100 g de CCAP® (lot CH 166) sont pesés sur une balance. La solution est chauffée à reflux pendant 20 min dans des conditions opératoires précises : le ballon doit être immergé dans un bain marie à une température de 90°C, avec une vitesse de rotation de 90 tours/min. La solution est évaporée jusqu’à obtenir un extrait d’une masse finale d’environ exactement 2 g. Environ exactement 3 g de méthanol sont ajoutés afin d’avoir une meilleure reprise de l’extrait. a solution

100

est filtrée sur une membrane de porosité 0,45 µm, avant injection en UHPLC-UV.

c) Cas de B1 : CCAP® repris dans le méthanol

Pour l’identification de B1 dans le produit fini, exactement 10,0 mL de CCAP® sont prélevés à l’aide d’une pipette jaugée puis introduits dans le ballon. La solution est chauffée à reflux pendant 20 min avec des conditions opératoires précises : le ballon doit être immergé dans un bain marie à une température de 90°C, avec une vitesse de rotation de 90 tours/min. La solution est évaporée jusqu’à obtenir un extrait d’une masse finale d’environ exactement 0,92 g. Environ 8 mL de méthanol sont ajoutés afin de permettre une meilleure reprise de l’extrait qui est transféré dans une fiole jaugée de 10,0 m . a fiole est complétée avec du méthanol jusqu’au trait de jauge. a solution est filtrée sur une membrane de porosité 0,45 µm, avant injection en UHPLC-UV.