Préparation d’échantillon de bois pour l’imagerie par spectrométrie de

La préparation d’échantillon en imagerie par spectrométrie de masse est tout à fait cruciale car il est nécessaire d’obtenir une surface plane, sans y apporter de pollution, ni délocaliser les substances se trouvant au sein du matériau à analyser. La préparation d’échantillon de tissus mous comme du cerveau de rat est bien établie au laboratoire pour ce type d’analyse. Cependant, les tissus durs comme la plupart des tissus végétaux sont plus difficiles à couper. À L’ICSN, l’étude de la distribution de flavonoïdes dans l’enveloppe de graines d’Arabidopsis thaliana a nécessité de mettre au point une préparation d’échantillon particulière à cause de la petite taille et de la dureté de ces graines [44]. Pour cela, les graines ont été enduites dans une résine de polyester avant d’être coupées par le couteau de diamant d’un ultra-microtome. Cette méthode a été inspirée par celle utilisée au laboratoire pour l’analyse d’échantillons du patrimoine culturel, comme par exemple des prélèvements de tableaux anciens [45]. Les coupes n’étaient pas récupérables mais les surfaces coupées étaient planes, ce sont celles-ci qui avaient été analysées. Dans la présente étude, l’objectif de la préparation d’échantillon a été d’obtenir des surfaces planes de bois permettant de différencier les cellules entre elles. Mais le bois est un matériau particulier car il est structuré en trois dimensions et sa dureté peut être relativement élevée pour certaines espèces.

Pour la préparation d’échantillon, les premiers essais consistaient à couper le bois avec le matériel à disposition, c’est-à-dire uniquement un cryo-microtome. Cette technique nécessite de congeler l’échantillon à -20 °C. Le fait de congeler l’échantillon a rendu celui-ci impossible à couper en fine tranche sans casser le tissu ou émousser la lame en acier inoxydable.

Ensuite c’est un microtome fonctionnant à température ambiante qui a été employé pour préparer de fines sections de bois. Celui-ci a été coupé selon une orientation radiale ou transversale. Cependant, il a été impossible de couper le bois dans le sens transversal. Sous cette orientation, la lame est placée perpendiculairement aux fibres du bois qui apportent une résistance mécanique contraignant la coupe. La Figure 19a présente une image obtenue au microscope optique d’une coupe radiale de D. guianensis obtenue à l’aide d’un microtome.

Une autre méthode permettant d’obtenir une surface plane de bois est le polissage, au moyen d’un disque d’abrasif en rotation. Cette technique a été essayée, mais des poussières de bois bouchant les cellules sont produites durant le processus de polissage. En diminuant la granulométrie de l’abrasif et en utilisant de l’eau pour retirer au fur et à mesure le dépôt de poussière, le bouchage des cellules peut être limité. En revanche des contaminations au polydiméthylsiloxane ont été détectées après analyse TOF-SIMS (données non montrées). La Figure 19b présente une photographie d’une surface tangentielle de bois polis prise au microscope optique.

Une autre stratégie consistait à ramollir le bois à l’aide d’une petite quantité d’eau. Un morceau de bois (1 cm × 1 cm × 1 cm) a été déposé dans un bécher contenant ~50 mL d’eau de qualité Milli-Q. L’échantillon « trempe » dans cette eau jusqu’à ce que celui-ci coule. Ensuite, à l’aide d’un microtome des sections transversales de 14 µm d’épaisseur sont

105 facilement obtenues avec ce bois « ramolli ». La Figure 19c illustre une image prise au microscope optique d’une section transversale de D. guianensis : il est possible sur celle-ci de distinguer les cellules de parenchyme axial et radial, les fibres et les vaisseaux.

La dernière méthode qui a été mise en place est celle de l’ultra-microtomie. Cette technique est proche de la microtomie sauf que ce ne sont pas des lames en acier inoxydable ou en carbure de tungstène qui sont utilisées mais des couteaux de verre ou de diamant. Cette technique n’a pas permis d’obtenir de fines sections, mais de couper au fur et à mesure la surface d’un petit cube de bois afin de l’aplanir. Les couteaux de verre ont été les premiers à être testés car ils ne sont pas onéreux. Une surface de bois a été aplanie, mais les cellules ont été bouchées par de la poussière de bois, cela est illustré en Figure 19d. Finalement ce sont des couteaux en diamant qui ont permis d’obtenir des surfaces planes, sans boucher les cellules comme est illustré en Figure 19e. La différence de qualité entre les échantillons obtenus avec le couteau de verre et avec celui de diamant peut s’expliquer par la différence de dureté et la qualité de l’affutage des couteaux.

Application de l’imagerie par spectrométrie de masse aux substances naturelles

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Figure 19 : Images au microscope optique de différentes méthodes de préparation de surface de D. guianensis. a) Coupe radiale au microtome. b) Surface tangentielle de D. guianensis poli c) Coupe transversale au microtome après

ramollissement dans l’eau d) Surface « rabotée » avec un ultra-microtome équipé d’un couteau de verre e) Surface « rabotée » avec un ultra-microtome équipé d’un couteau de diamant.

À cause des pollutions de surface apportées par la méthode de polissage, celle-ci n’a pas été retenue. La méthode d’ultra-microtomie avec un couteau de verre n’a pas non plus été retenue à cause du bouchage des cellules.

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IV.3.3. Choix de la méthode de préparation des coupes/surfaces transversales de