Prédiction et test in vivo des CRM liées par Svb

En collaboration avec S. Aerts, nous avons utilisé une méthode bioinformatique, développée pour détecter des motifs statistiquement surreprésentés dans un jeu de gènes co- exprimés, par rapport à l’ensemble des gènes de la drosophile (Aerts et al., 2007). Le programme « CisTargetX », intégrant l’analyse évolutive et des méthodes statistiques non basées sur des alignements locaux, a été utilisé pour l’analyse des 18 gènes cibles de Svb identifiés à cette période. Cette analyse porte sur les régions génomiques situées jusqu’à 5Kb en amont ou en aval de chaque gène, ainsi que celles correspondant à tous les introns. « CisTargetX » analyse ensuite ces séquences, dans les 12 génomes de Drosophile en parallèle, pour établir une liste pondérée de chacun de motifs, statistiquement enrichis dans les 18 gènes cibles de Svb. Les motifs analysés correspondent à une bibliothèque de 2000 sites de fixation connus pour des facteurs de transcription ainsi que des motifs conservés au cours de l’évolution (Elemento and Tavazoie, 2005).

Cette analyse montre que le motif Ovo est significativement surreprésenté dans l’ensemble des gènes cibles régulées par Svb, par rapport aux autres gènes de la drosophile et même par rapport à d’autres gènes épidermiques mais dont l’expression ne dépend pas de Svb. Si les motifs correspondants au site de fixation des protéines Ovo et Svb sont statistiquement enrichis dans ces gènes cibles, il faut noter qu’on ne détecte pas de regroupement local de ces sites, mais de 1 à 3 sites dans des régions de taille comprise entre 600pb et 1kb. Nous avons ainsi défini une liste de 17 CRMs candidats, à partir de 6 gènes cibles différents, dont 4 gènes ZPD : dyl, tyn, nyo et cyr, sur lesquels mes travaux ont plus particulièrement été centrés.

Pour tester la fonctionnalité in vivo de ces CRMs prédits par « Cis-TargetX », nous avons développé l’utilisation d’une nouvelle méthode de transgénèse, utilisant la recombinaison site spécifique PhiC31 (Bischof et al., 2007). Les régions testées correspondent à des fragments d’environ 1kb, centrés sur la position du(es) site(s) de liaison potentiel(s), insérés dans un

Figure 19 : Schéma de l’organisation génomique du gène tyn et expression des CRM.

La région EnTyn1 ne montre aucune expression. Le CRM EnTyn2 reproduit l’expression du gène tyn sous la dépendance de Svb.

Figure 20 : Schéma de l’organisation génomique du gène cyr et expression des CRM.

LA région EnCyrB ne présente aucune activité régulatrice. Le CRM EnCyrA reproduit l’expression du gène cyr sous la dépendance de Svb.

Figure 21 : Schéma de l’organisation génomique du gène nyo et expression des CRM.

Le CRM EnNyo1Ext reproduit l’expression du gène nyo sous la dépendance de Svb. La région EnNyo2Ext présente une faible activité transcriptionelle dans certaines cellules épidermiques, qui semble être sous la dépendance de Svb. La région EnNyo3 ne montre aucune activité transcriptionnelle.

vecteur rapporteur lac Z, contenant les séquences AttB (Markstein et al., 2008). Ce système présente l’avantage de s’intégrer dans une plateforme génomique (AttP) déterminée et donc à une position chromosomique connue et invariante entre différentes lignées. Chaque élément potentiellement régulateur est donc placé dans le même environnement chromatinien, évitant l’influence de la variation des sites d’insertion sur l’expression des différentes lignées transgéniques. Par cette approche, nous avons testé 9 CRMs candidats: 2 CRMs pour dyl, 2 CRMs pour cyr , 2 CRMs pour tyn et 3 CRMs pour le gène nyo .

Les CRM présomptifs du gène dyl correspondent à deux régions de ~1kb, localisées dans le premier intron (Endyl1) et autour du deuxième exon (Endyl2). Seul Endyl2 montre une activité dirigeant l’expression du gène lac Z similaire à celle du gène dyl endogène dans les cellules à denticules (figure 18). La fonction du CRM Endyl2 dépend de l’activité de svb, car l’expression du rapporteur est abolie dans des embryons mutants pour svb (figure 18). Les régions testées pour le gène tyn sont localisées dans le deuxième (Entyn1) et le premier intron (Entyn2). Alors que le CRM Entyn1 apparait non fonctionnel, Entyn2 dirige l’expression du gène rapporteur dans les cellules à trichomes, sous la dépendance de Svb (figure 19). De même, nous avons identifié un CRM fonctionnel et dépendant de Svb pour les gènes cyr : EncyrB (figure 20) et Nyo : Ennyo1Ext (figure 21).

Enfin, nous avons testé l’influence fonctionnelle des motifs correspondants aux sites consensus de liaison pour Ovo/svb. Le CRM Endyl2 comporte trois motifs potentiels et le CRM Entyn2 deux motifs potentiels Ovo/svb (en vert figure 18 et 19). L’inactivation simultanée, par introduction de 2 substitutions par motif, des sites de liaison potentiels, conduit à la perte de l’activité transcriptionnelle de ces deux éléments, Endyl2-OvoABC* et Entyn2-OvoAB*(figure 22). Ces résultats suggèrent donc que le facteur Svb se fixe directement sur ces motifs, dont l’influence individuelle et l’éventuelle coopérativité, au sein de chaque élément restent à évaluer. En résumé, sur les 9 régions testées in vivo, 4 présentent une activité transcriptionnelle dépendante de la fonction Svb dans les cellules épidermiques. Pour dyl et tyn, cette activité nécessite l’intégrité de motifs consensus pour la fixation des protéines Ovo/svb, suggérant que ces deux CRM sont des cibles génomiques directes du facteur de transcription Svb dans l’épiderme. Ces travaux permettent d’allonger à 7, la liste des CRMs dépendants de Svb que nous avons identifié.

Figure 22 : Importance des sites de liaison Ovo/Svb pour la fonction des CRM des gènes

dyl et tyn.

Vues latérales d’embryons au stade 16. Le CRM EnDyl2 reproduit l’expression endogène du gène dyl et cette expression est dépendante de Svb. Ce CRM contient 3 sites Ovo/Svb. La mutation simultanée de ces trois sites dans le CRM EnDyl2 (OvoABC*) abolit l’expression du transgène. Le CRM EnTyn2 reproduit l’expression endogène du gène tyn et cette expression est dépendante de Svb. Ce CRM contient 2 sites Ovo dont la mutation (OvoAB*) abolit l’expression du transgène.