Figure 42 : Dispositif E-gel utilisé pour récupérer les amplicons barcodés de la taille attendue lors de la préparation des
échantillons destinés au séquençage haut-débit Ion Torrent.
La taille des fragments a pu être évaluée à l’aide d’un marqueur de poids moléculaires
(25 ng/µl). Dans chacun des puits, 20 µL d’ADN barcodé ont été déposés. Dans les puits de
récupération, 25 µl d’eau sans nucléases ont été déposés pour récupérer l’ADN barcodés après la
migration (12 – 14 minutes). Lorsque la bande de la taille attendue s’est retrouvée au niveau des
puits de récupération, les échantillons ont été récupérés. Afin de récupérer la totalité des amplicons
dans les puits, 10 µL d’eau sans nucléases ont été ajoutés pour rincer les puits et transférés dans les
mêmes tubes de récupération (volume final de 30 µL environ).
3.3. Amplification des différentes « librairies »
Les différentes « librairies » obtenues pour chaque gène et chaque patient ont ensuite été
amplifiées selon le mélange réactionnel et le programme présentés dans les Tableaux 17 et 18.
Pour un read de 300 bases Pour un read de 200 bases Pour un read de 100 bases
Arrêter le run quand le marqueur 400 pb
est dans le puit de collection (ou quand le
marqueur 500pb est au niveau de le ligne
de référence)
Arrêter le run quand le marqueur 350 pb
est rentré complétement dans la partie
supérieure du puit de référence
Arrêter le run quand le marqueur 200 pb
est au milieu du puit de collection
139
Tableau 17 : Mélange réactionnel utilisé pour amplifier la « librairie » destinée au séquençage haut-débit Ion Torrent.
Réactifs Volume pour une réaction
SuperMix PCR Platinium haute fidelité 100 µl
Mélange d’amorces d’amplification de la
« librairie » 5 µl
« Librairie » (après sélection par E-gel) 25 µl
Total 130 µl
Tableau 18 : Programme de PCR utilisé pour amplifier la « librairie » destinée au séquençage haut-débit Ion Torrent.
Les échantillons ont, à nouveau, été purifiés à l’aide du kit « Agencourt® AMPure® XP ». Seule
la quantité de réactif initiale à ajouter varie par rapport aux précédentes purifications. Le volume de
réactif utilisé pour une « librairie » constituée d’amplicons barcodés de 200 bases était de 195 µl (soit
1,5 fois le volume de l’échantillon). Cette étape permet d’éliminer les nucléotides libres et les
éventuels dimères d’amorces formés lors de la PCR.
3.4. Mélange équimolaire des « librairies », PCR en émulsion et enrichissement
sur « Ion OneTouchTM Enrichment System »
A partir de ces étapes, les différentes « librairies » créées ont été mélangées et préparées
pour procéder à la réaction de séquençage sur puces. Différents types de puces ont été utilisées : des
puces 314 pour les souches de génotypes D et des puces 316 pour les souches de génotypes A et C.
Une puce par gène a été réalisée dans chacune des expériences. Il existe quelques différences selon
le type de puce utilisée (314 ou 316). Pour une puce 314, la concentration finale du mélange
équimolaire des « librairies » était de 2,4 pg/µL (correspondant à 16 pM) tandis que la concentration
finale pour les puces 316 était de 5,3 pg/µL (correspondant à 35 pM). Afin de procéder au mélange
équimolaire des « librairies », la quantité d’amplicons présente dans chaque « librairie » a été dosée
à l’aide du fluorimètre Qubit ®. Pour cela, 3 µL de la « librairie » obtenue pour chaque patient ont été
dosés, après avoir été préalablement mis en contact pendant deux minutes avec 197 µL d’une
solution tampon comprenant 1 µL de réactif Qubit® interagissant avec l’ADNdb. A partir des
quantités obtenues, chaque « librairie » barcodée a été diluée dans du LowTE à une concentration
finale de 24 ou 53 pg/µL selon la puce utilisée. Puis, 5 µL de chaque échantillon ont été mélangés
Etape Température Temps Nombre de cycles
Dénaturation initiale 95 °C 5 minutes 1 cycle
Dénaturation 95 °C 15 secondes
8 cycles
Hybridation 58 °C 15 secondes
140
dans un tube LoBind. Ce mélange équimolaire des « librairies » barcodées a ensuite été dilué au
10
ème pour obtenir une concentration finale de 2,4 ou 5,3 pg/µL, selon la puce utilisée, dans un
volume de 30 µL.
A partir de ce mélange, une PCR en émulsion a été réalisée. Ce procédé permet de générer
des micro-réacteurs contenant une seule sphère où, idéalement, une unique copie d’ADN va être
amplifiée par PCR. Cette PCR en émulsion a été réalisée à l’aide de l’appareil « Ion OneTouch
TM 2 »
(Life Technologies). L’amplification clonale des « librairies » sur les sphères (« Ion Sphere Particules »,
ISP) a été réalisée grâce au kit « Ion Personal Genome Machine (PGM)
™ Template OT2 200 » (Life
Technologies). L’utilisation du « Ion OneTouch
TM 2 » est décrite dans le manuel en ligne « Ion PGM ™
Template OT2 200 Kit user guide ». Ainsi, 25 µL du mélange équimolaire des « librairies » (2,4 ou
5,3 pg/µL) ont été ajoutés au mélange réactionnel suivant : 25 µL d’H
2O, 500 µL de « Reagent mix »,
300 µL de Reagent B », 50 µL d’ « enzyme mix », 2,4 ou 5,3 pg/µL du mélange équimolaire des
« librairies » ont été ajoutés.
Ce mélange a été mis en contact avec 100 µL d’ISPs, mélangé, puis transféré dans le filtre du
« Ion OneTouch » avec de l’huile pour la réaction en émulsion. Le filtre est ensuite déposé au niveau
du « Ion OneTouch
TM 2 », préalablement préparé pour réaliser la PCR en émulsion. Une
centrifugation est réalisée par l’appareil à la fin de la PCR en émulsion afin de récupérer le culot
contenant les sphères avec les « librairies » fixées dessus. Après avoir éliminé le surnageant, les
sphères ont été lavées avec 500 µL de « Ion OneTouch Wash Solution » fournies dans le kit. Une
seconde centrifugation à 15 000 g pendant deux minutes et 30 secondes a été réalisée et le
surnageant a, de nouveau, été éliminé sauf 100 µL. Les sphères ont été remises en suspension dans
les 100 µL restants.
Afin de vérifier la qualité des sphères, et la proportion des sphères non enrichies, 2 µL de
cette solution ont été utilisés. Le kit « Ion Sphere Quality Control » a été utilisé pour réaliser le
mélange réactionnel suivant : 2 µL de la solution contenant les sphères, 19 µL d’ « Annealing Buffer »
et 1 µL de « Ion Probes ». Ce mélange a été chauffé à 95°C pendant deux minutes puis à 37°C
pendant deux minutes. Le mélange a ensuite été lavé avec 200 µL de « Quality control wash
solution » et centrifugé à 15 500 g pendant une minute et 30 secondes. Le surnageant a été éliminé
sauf 10 µL. Ce lavage a été réalisé trois fois de suite. Lors du dernier lavage, 190 µL de « Quality
control wash solution » ont été ajoutés et transférés dans un tube pour un dosage avec le
fluorimètre Qubit®. Le calcul du rapport entre les valeurs des fluorochromes AF488 et AF467 (après
déduction du bruit de fond) a permis de déterminer le pourcentage de sphères positives. Celui-ci doit
idéalement se situer entre 10 et 30 %.
L’étape suivante avait pour but de sélectionner et d’enrichir les sphères dites « matrice
positive » avec l’automate « Ion OneTouch
TM Enrichment System » (Life Technologies) et les réactifs
141
du kit « Ion PGM™ Template OT2 200 Kit ». Sur une barrette de puits, différents réactifs ont été
préparés et déposés dans les puits correspondants suivant les recommandations du fournisseur : une
solution contenant les billes magnétiques « Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beads » permettant
l’immobilisation des sphères présentant une molécule d’ADN (réaction biotine/streptavidine) sur
l’aimant pour la purification, des solutions de lavage, une solution Melt-off contenant du NaOH
permettant la dénaturation de l’ADNdb en ADNsb au niveau des sphères. Une solution de
neutralisation a préalablement été déposée dans le tube de récupération des sphères dites
« matrice-positive ». A la fin du run, 230 µL de sphères enrichies ont été récupérés dans le tube de
récupération et stockés à +4°C.
3.5. La réaction de séquençage sur le « Ion Personal Genome Machine (PGM) »
L’étape suivante consiste à planifier le run sur un ordinateur de l’appareil PGM (la méthode
utilisée, le nom des barcodes, le type de puce, la séquence de référence…), nettoyer le PGM (lavage
au chlorite, lavage à l’eau) et initialiser le PGM (préparation des bouteilles de lavage, préparation des
dNTPs, Nucleosides triphosphates), selon les recommandations du fournisseur, afin de procéder au
séquençage sur puces. Les recommandations du fournisseur sont présentées sur le guide « Ion PGM
Sequencing 200 kit v2 » de Life Technologies.
Avant de procéder aux dépôts des sphères enrichies dans la puce, une étape d’hybridation
