POTENTIELLE DANS LES CELLULES TUMORALES MYELOÏDES

I.

INTRODUCTION

La protéase aminopeptidase-N (APN/CD13) est une métalloprotéase intrinsèque de la membrane plasmique possèdant un domaine extracellulaire composé d'une région contenant le site catalytique de l'enzyme. Plusieurs isoformes de CD13 ont été mises en évidence, reflétant des variations en glycosylation de la protéine.

L’expression constitutive de cette protéase varie énormément selon les tissus et les types cellulaires considérés. Elle est détectable sur les cellules épithéliales (rein, entérocytes, système nerveux central), les fibroblastes et dans le système hématopoïétique sur les cellules du lignage granulocyte-monocyte, les cellules souches CD34+CD38-, les progéniteurs myéloïdes CD34+CD38+ et les cellules dendritiques myéloides matures. Les lymphocytes T/B normaux ainsi que la vascularisation normale n’expriment pas CD13. Des formes solubles sont présentes dans les plasma/sérum et urine mais le mécanisme de libération de la forme membranaire de CD13 n’est pas connu.

APN/CD13 est anormalement induite ou surexprimée dans des maladies inflammatoires (comme l’arthrite rhumatoïde et la sclérose multiple), dans certaines tumeurs solides (rein, mélanome, sein, prostate) et hématologiques comme les leucémies myéloïdes, aiguës et chroniques et la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) (Bauvois & Dauzonne 2006)

Bien que l’ARNm de CD13 soit présent dans les cellules vasculaires endothéliales (Fukasawa et al. 2006), seules les cellules endothéliales jouxtant les tumeurs solides expriment la protéine à leur surface (R Pasqualini et al. 2000)

Par le métabolisme d’hormones plasmatiques (angiotensine III, encéphaline, somatostatine, et neurokinine A), APN/CD13 participe à divers processus physiologiques (perméabilité vasculaire, neurotransmission, sécrétion digestive, réponse inflammatoire). Cette protéase est aussi directement impliquée dans la protéolyse de chimiokines (MCP-1, MIP-1) et pourrait agir sur des composants de la matrice extracellulaire déjà clivés par d’autres endoprotéases comme la plasmine ou la matrix metalloproteinase-9 et ainsi contribuer à la cascade du mécanisme d’invasion des cellules tumorales (Bauvois & Dauzonne 2006), (D Riemann et al. 1999).

Initialement, les expériences visant au blocage de CD13 par différentes approches comme l’utilisation d’inhibiteurs de l’activité enzymatique, d’anticorps, et d’antisens a permis de suggèrer que CD13 pourrait participer à la progression tumorale et à l’angiogenèse associée en agissant sur les cellules endothéliales et sur les cellules tumorales (Bauvois & Dauzonne 2006). L’inhibition in vitro de CD13 dans des modèles de tumeurs est accompagnée par un blocage de la prolifération, de la capacité invasive et de la sécrétion en cytokines (IL-6 , IL-8) (Bauvois & Dauzonne 2006). Les antagonistes d’APN/CD13 (bestatine, amastatine, anti- CD13 : WM15 et MY7) abrogent la capacité des cellules endothéliales à former un réseau capillaire (formation des tubes) sans cependant altérer leur capacité proliférative (R Pasqualini et al. 2000), (Bhagwat et al. 2001),(Hashida et al. 2002), (Bauvois & Dauzonne 2006).

111 Des observations plus récentes dans le modèle de souris avec le gène éteint pour CD13 indiquent que ces souris sont viables et se développent normalement, sans altérations cardiovasculaire, neurologique, metabolique et hématologique (Rangel et al. 2007),(Winnicka et al. 2010). Ces souris ont une hématopoïèse normale et une fonction normale des cellules myéloides (phagocytose, présentation d’antigènes) (Winnicka et al. 2010). CD13 n’apparait pas essentielle pour la vasculogenèse (formation de novo des vaisseaux sanguins) et l’angiogenèse physiologique (formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux existants). Cette dernière observation suggère qu’il existe probablement d’autres substrats angiogéniques que l’angiotensine IV issue de la dégradation de l’angiotensine III par CD13 (Rangel et al. 2007). Cependant l’absence de CD13 réduit fortement la réponse angiogénique à l’hypoxie (néovascularisation de la rétine après hypoxie) soulignant le rôle de CD13 dans l’angiogenèse pathologique (Rangel et al. 2007).

Même si CD13 ne semble pas contribuer directement au développement hématopoïétique et à la fonction des cellules myéloides, elle reste une molécule d’intérèt thérapeutique. En effet dans le cadre du développement de nouvelles thérapies anti tumorales, des recherches sont orientées vers le ciblage d’antigènes tumoraux qui pourraient déclencher des signaux intracellulaires conduisant au blocage de la prolifération ou à l’induction d’apoptose. CD13 étant surexprimé dans les LAM, il pourrait représenter une cible potentielle.

L’efficacité des inhibiteurs de l’activité enzymatique d’APN reste cependant, pour la plupart, limitée et contrastée du fait de leur cytotoxicité et spécificité non restreinte à CD13. Ainsi, les essais cliniques impliquant la bestatine pour le traitement de leucémies myéloides aiguës et chroniques (LAM et LMC) n'ont pas été poursuivis en raison de la cytotoxicité élevée de cette molécule et de son manque de spécificité restreinte à CD13 (Bauvois & Dauzonne 2006). La collaboration entre les groupes de recherche de Brigitte Bauvois et de Daniel Dauzonne (Institut Curie, CNRS UMR 176) s’est articulée autour d’un axe principal émanant de la synthèse de dérivés flavoniques originaux (D. Dauzonne) et le rôle de CD13 dans les cellules de LAM (B. Bauvois). En 2004, ils ont identifié une molécule non cytotoxique (acide 2',3- Dinitroflavone-8-acétique/DNFAA) en tant qu’inhibiteur d’APN/CD13. Cette molécule est maintenant commercialisée par EMD Biosciences Inc (San Diego, CA) (revendeur Calbiochem n°164602).

Le but de notre travail a été de rechercher si l’inhibition de CD13 par DNFAA et/ou sa ligation par des anticorps monoclonaux dirigés contre différents épitopes de CD13 pourraient affecter la prolifération et la survie des cellules leucémiques.

1

Aminopeptidase-N/CD13 is a potential pro-apoptotic target in human myeloid tumor cells

1

Marion Piedfer*, #,§, Daniel Dauzonne$, Ruoping TangΠ, Juliette N’Guyen , Christian Billard*, #,§, and Brigitte Bauvois*, #,§,1

*

Centre de Recherche des Cordeliers, INSERM U872, Equipe 18, Paris, France;

#

Université Pierre et Marie Curie, UMRS 872; Paris, France;

§

Université Paris-Descartes, UMRS 872, Paris, France;

$

CNRS 176, Institut Curie, Paris, France;

Π_{Département d’Hématologie, Hôpital St Antoine, Paris, France;}

Département Maladies Infectieuses, Hôpital Cochin, Paris, France.

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Correspondence: Centre de Recherche des Cordeliers INSERM U872, 15 rue de l'Ecole de Médecine, F-75270 Paris cedex 06, France. E-mail: brigitte.bauvois@crc.jussieu.fr

Short title: CD13 targeting in human myeloid leukemia

2 ABSTRACT

The transmembrane metalloprotease aminopeptidase-N (APN)/CD13 is overexpressed in various solid and hematological malignancies in humans including acute myeloid leukemia (AML) and is thought to influence tumor progression. We sought to investigate the

contribution of APN/CD13 to the regulation of growth and survival processes in AML cells in vitro. Anti-CD13 monoclonal antibodies MY7 and SJ1D1 (which do not inhibit APN activity) and WM15 (an APN-blocking antibody) inhibited the growth of the AML cell line U937 and induced apoptosis, as evidenced by cell accumulation in the sub-G1 phase, DNA

fragmentation and phosphatidylserine externalization. Isotype-matched IgG1 and the APN/CD13 enzymatic inhibitors bestatin and 2’,3-dinitroflavone-8-acetic acid, were

ineffective. Internalization of CD13-MY7 complex into cells was followed by mitochondrial membrane depolarization, Bcl-2 and Mcl-1 downregulation, Bax upregulation, caspase-9,-8 and -3 activation and cleavage of the caspase-3 substrate PARP-1. The broad-spectrum caspase inhibitor Z-VAD-fmk and the caspase-9- and -8-specific inhibitors significantly attenuated apoptosis. CD13 ligation also induced apoptosis and PARP-1 cleavage in primary AML blasts, whereas normal blood cells were not affected. Overall, these data provide new evidence that CD13 can serve as a target for inducing caspase dependent-apoptosis in AML (independently of its APN activity). These findings may have implications for tumor biology and treatment.

3 INTRODUCTION

Aminopeptidase-N (APN)/CD13 (EC 3.4.11.2) is a transmembrane protease present in many tissues and cell types (e.g. endothelial and epithelial cells, fibroblasts and leukocytes) (1). CD13 expression is dysregulated in inflammatory diseases and in solid and hematological tumors (1). Furthermore, CD13's enzymatic activity modulates the responses of bioactive peptides (e.g. vasoactive peptides, neuropeptides and chemokines)(1). The CD13 protein is also a receptor for coronaviruses (1). Several natural and synthetic APN inhibitors have been characterized and used to reveal that CD13 can influence major biological processes,

including cell growth and invasion and angiogenesis in various cellular systems (1-3). CD13's involvement in these processes has mostly been confirmed by blockage with anti-CD13 monoclonal antibodies (mAbs) (2-9). However, the molecular mechanisms underlying these effects have yet to be described in detail. Indeed, it is not clear whether APN enzymatic activity is required for CD13's other functions. Some researchers have suggested that signal transduction accounts for some of CD13's functions (10-12). With regard to apoptosis, the presence of CD13 correlates with neutrophil resistance to TNF-α-induced apoptosis via reduced shedding of TNF-receptor I (13). Although studies with APN inhibitors have indicated a potential role for CD13 in apoptosis, this effect remains controversial because high doses of the inhibitors used might induce cytotoxicity in a non-specific manner (1, 12).

Acute myeloid leukemia (AML) is a deadly disease characterized by the clonal expansion and accumulation of hematopoietic stem cells arrested at various stages of development. The latter are used to define distinct AML subfamilies (14-16). CD13 is strongly expressed on stem cells and leukemic blasts in all AML subtypes (1, 16). Leukemia cells are unable to undergo (i) growth arrest, (ii) terminal differentiation, (iii) apoptosis in response to appropriate environmental stimuli and disseminate from the bone marrow into peripheral

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tissues (14-16). There are no data on CD13's possible functions in AML cells or its contribution to the course of the disease.

In the present study, we investigated and compared the effects of anti-CD13 mAbs and inhibitors of APN/CD13 enzymatic activity on the AML cell line U937 in vitro and AML patients’ cells ex vivo. In contrast to APN inhibitors, anti-CD13 mAbs induced growth arrest and apoptosis in AML cells. We identified some of the molecular apoptotic pathways

triggered by CD13 ligation and that led to mitochondrial membrane depolarization, caspase activation and the alteration expression of Bcl-2 family proteins known to be involved in the control of mitochondrial-dependent apoptosis.

MATERIALS AND METHODS