Possible next steps

Além da diversidade de métodos empregados, vários tipos de desenho amostral podem ser utilizados, dependendo do estudo que será realizado. Desenhos amostrais com coleta de dados em pontos aleatórios no ambiente são importantes para garantir uma boa representatividade da amostra e análises estatísticas confiáveis (Gotelli and Ellison, 2013). No entanto, a relevante variabilidade espacial na distribuição de organismos em ecossistemas rochosos intertidais gera desafios na medição de padrões de abundância nesses hábitats (Hartnoll and Hawkins, 1980; Underwood, 1992). Em algumas situações, como distribuição agregada de organismos, em manchas, um desenho amostral aleatorizado dentro de estratificações pode ser mais adequado para reduzir a influência da variabilidade espacial. A escolha de métodos e desenho amostral mais eficientes para determinado ambiente deve gerar dados que represente a comunidade estudada com o mínimo de esforço de coleta (Ballesteros, 1986; Krebbs, 1999). Como fatores mensuradores de esforço, estão o tempo gasto em campo, custo financeiro da coleta e mortalidade dos organismos estudados, por exemplo. Índices de biodiversidade, como riqueza, diversidade de Shannon e dominância de Simpson, vêm sendo utilizados como estimadores para comparação de estrutura de comunidades (Chao et al., 2014), sendo utilizados de acordo com a abordagem de estudo.

A maioria dos trabalhos tem se concentrado em costões rochosos de ambientes temperados e subtropicais (Barboza et al., em preparação). Nesses ecossistemas, geralmente se observa uma zonação vertical bem definida, sendo comum a presença de manchas horizontais caracterizadas pela presença de uma espécie dominante (Stephenson and Stephenson, 1949). Por outro lado, há uma carência de estudos em substratos rochosos intertidais de baixa inclinação, sujeitos a pequena amplitude de marés, com maior diversidade de espécies e de habitats, como os encontrados nas áreas tropicais (Barboza et al., em preparação), região onde geralmente se encontra uma maior heterogeneidade de substratos rochosos e biológicos (Satyam and Thiruchitrambalam, 2018).

Visando definir os melhores método e desenho amostral para levantamento de macroinvertebrados bentônicos na área intertidal em dois recifes rochosos tropicais de baixa inclinação e de diferentes tipologias, testamos métodos já utilizados na literatura (Barboza et al., em preparação). Neste ensaio, contemplamos abordagens aleatórias com quadrados e com quadrados associados a transectos, e outra abordagem estratificada, com quadrados associados a transectos em manchas. Nossa hipótese é que, independente da tipologia do recife, um levantamento feito com quadrados associados a transectos em uma abordagem dentro de manchas será a que melhor representará a riqueza da comunidade estudada, uma vez que o uso do transecto resultaria em menor tempo em campo, e uma abordagem dentro de manchas contemplaria as diferentes espécies associadas a cada uma delas. Para testar nossa hipótese, utilizamos moluscos e equinodermas como táxons alvo desse estudo porque são organismos frequentes em áreas intertidais rochosas e que desempenham importantes papeis ecológicos, podendo atuar, por exemplo, como bioindicadores (Gladstone, 2002), bioerodidores (Griffin et al., 2003) e reguladores populacionais de outras espécies (Wright et al., 2005). Além disso, são mais fáceis de amostrar e identificar taxonomicamente em campo em relação a outros grupos, como crustáceos e poliquetas.

2. Materiais e métodos

2.1. Área de estudo

A área de estudo está localizada no litoral oriental do Estado do Rio Grande do Norte (RN) / Brasil (5º 5´ S - 35º 40´ O a 6º30´S - 34º 58´ O) (Figura 1), inserida dentro da Região Metropolitana de Natal, incluindo as praias de Santa Rita (município de Extremoz) e Praia do Meio (município de Natal). Esta região está situada sobre terrenos sedimentares do grupo Barreiras, com predomínio de arenitos, apresentando cordões recifais de arenito (beachrocks) como um dos elementos da faixa litorânea (Short and Klein, 2016; RIO GRANDE DO NORTE, 2013; Vieira and Ros, 2006; Vieira et al., 2007). O clima da área é o tropical úmido, com período chuvoso de fevereiro a setembro, precipitação pluviométrica anual em torno de 1.500mm, temperatura média anual de 27ºC e umidade relativa média anual de 76% (RIO GRANDE DO NORTE, 2013). Os dados médios de temperatura e salinidade do mar são de 28,31ºC e 35,87 ups no período seco e 28,87ºC e 34,16 ups no período chuvoso, respectivamente (Hazin et al., 2008).

Os recifes areníticos do litoral oriental do RN estão sujeitos a um regime de marés semidiurno, com variação da maré de 0,1m a 2,7m. Apresentam-se de forma descontínua ao longo da linha de praia, podendo ser formações de quilômetros de extensão paralelas à costa ou corpos rochosos isolados com apenas alguns metros de extensão (Branner, 1904; Vieira et al., 2007). As áreas rochosas podem ser interrompidas por faixas de mar ou de areia, de grandes ou pequenas extensões. Em cada praia, foi escolhida a maior porção rochosa contínua para ser amostrada. As localidades escolhidas apresentam duas tipologias diferentes de recifes, categorizadas em função da estabilidade do substrato e do grau de exposição às ondas.

O recife de Santa Rita (5°41'38.0"S; 35°11'45.7"O; Figura 2), aqui classificado como de Tipologia com Blocos Rochosos e Abrigados (TBRA), caracteriza-se pela

Figura 1. Mapa de localização dos recifes estudados, nas praias de Santa Rita e do Meio, em

presença de blocos de rochas, que podem estar soltas sobre o sedimento ou sobre outras rochas ou podem estar cimentadas/aglomeradas. O tipo de cobertura de substrato é heterogêneo, sendo encontradas, predominantemente, rochas nuas, mas, também, aquelas cobertas por sedimento, zoobentos sésseis, como cirripédios, e diversos grupos de fitobentos, como algas folhosas, ramificadas e calcárias (observação in situ). A área amostrada tem, aproximadamente, 400 metros de extensão (paralela à costa) e 100 metros de largura na extremidade mais estreita e 200 metros de largura na extremidade mais larga, com presença de poças de marés ao longo do recife. Considerando-se poças de marés como um micro-ecossistemas de características intrínsecas, optou-se por não amostrar áreas de poças com mais de 50 cm de profundidade no presente trabalho.

Já o recife amostrado na Praia do Meio (5°46'29.0"S; 35°11'36.5"W; figura 2), aqui classificado como de Tipologia Platô Rochoso e Exposto (TPRE), apresentando-se em forma de platô elevado, com declividade suave em direção ao mar, onde ocorre grande embate de ondas, e também em direção à praia. A área amostrada tem, aproximadamente, 440 metros de extensão (paralela à costa) e 30 metros de largura, também com presença de poças de marés ao longo do platô. A cobertura do substrato também é diversa, sendo encontradas algas do grupo Ectocarpales, assim como outras espécies de macroalgas folhosas, ramificadas e calcárias, cianobactéria e zoobentos sésseis (como cirripédios, moluscos bivalves e vermetídeos) (observação in situ).A borda do recife voltada para o mar apresenta uma faixa paralela caracterizada pela presença de aglomerados de poliquetas do gênero Phragmatopoma. No entanto, esta faixa não foi amostrada devido ao forte embate de ondas no local, oferecendo risco de acidente aos pesquisadores.

Figura 2. Fotos dos recifes estudados: Praia de Santa Rita (esquerda), com recife de Tipologia com Blocos

2.2. Testes de métodos de levantamento bentônico

A escolha dos métodos a serem testados foi baseada em literatura existente, principalmente no levantamento bibliográfico realizado por Barboza et al. (em preparação), e em características ambientais dos recifes amostrados. Optou-se por comparar três metodologias: (1) amostragem em quadrados posicionados aleatoriamente nos recifes (Quadrados Aleatórios) e amostragem em quadrados associados a transectos em cinto, em (3) uma abordagem com os transectos posicionados aleatoriamente sobre o recife (Transectos Aleatórios) e (3) em abordagem com transectos posicionados aleatoriamente dentro de manchas de hábitats (Transectos dentro de Manchas).

Os dados foram coletados no início da estação chuvosa. Foram registrados dados de abundância dos táxons de moluscos e equinodermas bentônicos em amostradores de tamanhos diferentes, de acordo com o tamanho dos organismos. Optou-se por utilizar o método de estimativa por censo visual, amplamente utilizado em ambientes de substrato consolidado (por exemplo, Chapman 2005; Cordeiro et al., 2014; Lang et al., 2010, Leão et al., 2015), de maneira a evitar a coleta, e consequente morte, desnecessária de organismos. No recife de tipologia com blocos rochosos e abrigados (TBRA), foi empregada uma metodologia de levantamento de dados embaixo das rochas (Chapman, 2003; Chapman, 2005; Martins et al., 2010). A área total amostrada em cada praia foi de 200m2 em cada método, visando a padronização do esforço amostral. O tempo gasto na aplicação de cada método foi quantificado.

2.2.1. Método de Quadrados Aleatórios (QA)

Para o método de levantamento bentônico utilizando Quadrados Aleatórios (QA) como amostradores (Figura 3) (por exemplo, Coimbra, 1998), utilizamos 200 quadrados de tamanhos de 1m x 1m, para levantamento da megafauna (considerados aqui organismos com tamanho aproximado maior do que 5cm). Dentre os 200 quadrados, foram sorteados 40 onde a macrofauna foi amostrada dentro de quadrados aninhados: quadrados de 50cm x 50cm foram utilizados para contagem do número de indivíduos de cada espécie da macrofauna de tamanho aproximado entre 2cm e 5cm, aqui denominada “macrofauna maior”; e quadrados de 20cm x 20cm, para contagem da macrofauna de tamanho aproximado entre 3mm e 2cm, visíveis a olho nu, denominada “macrofauna menor”. Os subquadrados tiveram seu ponto fixo em relação ao quadrado maior para otimização do trabalho em campo, em que os quadrados menores foram posicionados no canto superior direito dos quadrados maiores (levando em consideração a posição do observador de frente para o mar).

No recife TBRA, em cada quadrado de 50cm x 50 cm amostrado também foram contabilizados indivíduos de cada táxon (móveis e sésseis) na porção inferior de duas rochas de tamanhos diferentes (Figura 4): a maior e a menor, considerando-se apenas aquelas rochas cujo tamanho mínimo de uma de suas larguras fosse aproximadamente 13

cm, correspondendo a tamanho mínimo de rocha onde geralmente se encontra organismos (observação in situ).

2.2.2. Método de Transectos Aleatórios (TA)

O segundo método consistiu no uso de Transectos Aleatórios (TA) (com base, por exemplo, em Miller and Ambrose, 2000) com quadrados aninhados de diferentes tamanhos (Figura 5). Para levantamento da megafauna, foram traçados 20 transectos em cinto, de 10 m x 1 m, cada, posicionados aleatoriamente sobre cada recife. A posição dos transectos em relação à costa foi sorteada, de forma que metade dos transectos foi amostrada de forma paralela e a outra metade, de forma perpendicular à linha de costa

1m 50cm 20cm 1m 50cm 20cm

Figura 3. Aplicação em campo do método de Quadrados Aleatórios (esquerda) e esquema representativo

da disposição dos quadrados (direita).

Figura 4. Amostragem de macroinvertebrados bentônicos

(Miller and Ambrose, 2000), com o intuito de melhor se contemplar a variabilidade espacial.

Para levantamento da macrofauna maior, dentro de cada transecto foram alocados dois quadrados de 50cm x 50cm, um no início e outro no meio (em pontos fixos, para otimizar a logística em campo). E para levantamento da macrofauna menor, quadrados de 20 cm x 20 cm foram aninhados dentro dos quadrados de 50 cm x 50 cm, da mesma forma que o método QA descrito no subitem anterior. No recife TBRA a porção inferior das rochas soltas também foi amostrada, seguindo a mesma metodologia descrita no item anterior, do método QA (duas rochas por quadrado de 50cm x 50cm).

2.2.3. Método de Transectos dentro de Manchas (TM)

O terceiro método escolhido, Transectos dentro de Manchas (TM), baseia-se em teorias da ecologia de paisagens e em trabalhos realizados em costões rochosos que levaram em consideração os tipos de manchas de hábitat (Berchez et al., 2005; Ghilardi et al., 2008). Foi realizada uma busca ativa para identificação e georreferenciamento das

Figura 5. Aplicação do método de Transectos: a) transecto em cinto utilizado para levantamento da

megafauna; b) quadrados alocados dentro do transecto para levantamento de macrofauna maior e macrofauna menor; c) desenho esquemático do método de Transectos.

C B A 5m 10m 1m 50cm 20cm

manchas visualizadas. Neste caso, a coleta foi feita como no segundo método aqui apresentado (TA - Figura 5), porém, o recife amostrado foi estratificado com base em características da cobertura de substrato e os transectos foram aleatorizados dentro das manchas de hábitats identificadas.

No recife TPRE, foram identificadas quatro manchas (Figura 6), denominadas de Borda, Platô, Braquidontes e Craca. Foram traçados seis, oito, quatro e dois transectos em cada mancha, respectivamente, proporcionalmente ao tamanho de cada uma delas. A mancha Borda corresponde à faixa do recife mais próxima à linha do mar, correspondendo à área que passa menos tempo descoberta, com presença de poças de maré, e, na maioria de sua extensão, apresenta predomínio de macroalgas em relação ao restante do recife. A mancha Platô equivale à faixa central do recife, também com poças de maré e presença de macroalgas, embora em menor densidade e geralmente diferentes espécies em relação à Borda; o ouriço-do-mar Echinometra lucunter é o animal bentônico dominante nesta mancha. Já a mancha Braquidontes equivale à uma faixa na borda do recife voltada para a linha de praia, correspondendo a um tapete de bivalves do gênero

Brachidontes. Por último, a mancha Craca, equivale a áreas nas duas extremidades

laterais do recife, com predomínio de rochas nuas e cirripédios e com maior tempo de emersão.

No recife TBRA, foram identificadas quatro manchas (Figura 7): Rocha, Rocha com Areia, Borda e Borda com Areia. Foram traçados nove, três, três e quatro transectos

C

A B

D

Figura 6. Manchas de hábitats identificadas no recife de Tipologia Platô Rochoso Exposto (TPRE): a)

em cada mancha, respectivamente. A mancha Rocha equivale à área com maior tempo de emersão, presença de poças e predomínio de rochas nuas; Rocha com Areia, áreas de rocha com presença abundante de sedimento, em relação às demais partes; Borda equivale à faixa do recife mais próxima à linha da maré, com cobertura do substrato mais heterogênea, com presença de macroalgas e zoantídeos; e Borda com areia, área de borda com presença abundante de sedimento, em relação às demais partes.

2.3. Análises dos métodos testados

Para testar as diferenças na composição dos táxons entre os três diferentes métodos empregados, foi realizada uma Análise de Variância Multivariada Permutacional (PERMANOVA) para cada recife, a partir de dados de abundância de cada táxon. Foi aplicado o critério FDR (False Discovery Rate) para valor ajustado de significância (Benjamini and Hochberg, 1995). Esta análise foi feita no programa R (R Core Team, 2017) com o pacote vegan (Oksanen et al, 2018).

Foi gerada uma tabela com o número de ordens, famílias, gêneros, espécies e espécies exclusivas para cada método, em cada recife estudado. Elaborou-se também uma lista com a densidade e a ocorrência dos táxons visualizados por método, em cada tamanho de amostrador, para cada recife. Foram considerados táxons raros (R) aqueles com frequência de ocorrência relativa menor do que 5%; táxons frequentes (F), frequência

C

A B

D

Figura 7. Manchas de hábitats identificadas no recife de Tipologia com Blocos Rochosos Abrigado

de ocorrência relativa entre 6% e 49%; e táxons comuns (C), frequência de ocorrência relativa a partir de 50%.

A riqueza de táxons entre os métodos foi comparada para cada recife por curvas de rarefação e extrapolação, utilizando como referência os trabalhos de Colwell et al. (2012), Chao et al. (2014) e Hsieh et al. (2016). Para tanto, foi utilizado o pacote iNEXT (Chao et al., 2014; Hsieh et al., 2018) do programa R (R Core Team, 2017). O nível de significância da similaridade entre as riquezas obtidas com os diferentes métodos foi avaliado pelo intervalo de confiança (0,95) das curvas (Colwell et al., 2012; Chao et al., 2014). Dentre os métodos analisados, aquele que apresentou maior riqueza associada a menor tempo de coleta foi considerado o mais apropriado.

3. Resultados

Os resultados de densidade e ocorrência dos táxons por método em cada recife estão apresentados nas tabelas 1 e 2 do Anexo 1. No recife de Tipologia Platô Rochoso e Exposto (TPRE), a maior densidade total de organismos (13496 indivíduos/m2) foi registrada com o método de Quadrados Aleatórios (QA), em contraste com 9506 ind./m2

e 8606 ind./m2 _{registrados com os métodos de Transectos em Mancha (TM) e Transectos}

Aleatórios (TA), respectivamente. Essa discrepância foi em decorrência de uma única espécie da macrofauna, o gastrópode Echinolittorina lineolata, que ocorre em grandes densidades no recife TPRE, tendo, assim, maior registro de densidade com o método QA, mas sendo bem representada em todos os métodos. Quando observamos os valores da megafauna, apenas uma espécie foi registrada com todos os métodos testados, o ouriço

Echinometra lucunter. Porém, sua frequência de ocorrência foi três vezes maior com a

amostragem em TA do que com QA. Nos métodos TA, TM e QA, as porcentagens de táxons raros amostrados em relação aos táxons totais foram de 28,5%, 28,5% e 40%, respectivamente. Apesar da maior porcentagem de táxons raros ter sido registrada em QA, metade desses táxons (Stramonita spp. e Fissurelidae) foram registrados como frequentes quando o método utilizado foi TA ou TM.

Já nos recifes de Tipologia com Blocos Rochosos e Abrigados (TBRA), a maior densidade de organismos (1200 ind./m2) foi registrada com o método TM, seguida pelos métodos TA (692 ind./m2) e QA (115 ind./m2). Esses valores altos são em decorrência da abundância de apenas dois táxons da macrofauna séssil: Brachidontes sp. e Isognomon

bicolor. Nos métodos TA, TM e QA, as porcentagens de táxons raros amostrados em

relação aos táxons totais foram de 42,2%, 39% e 39%, respectivamente. Observou-se que o registro de cada táxon ocorreu quase exclusivamente em um determinado tamanho de amostrador, dependendo de cada táxon.

Em relação à composição de táxons, não houve diferença significativa entre os diferentes métodos testados, nem no recife TPRE (PERMANOVA, F = 1,35, p=0,12), nem no recife TBRA (PERMANOVA, F = 1,32, p = 0,19), indicando que todos os métodos testados apresentaram similaridade na composição das comunidades amostradas. No recife TPRE, foram encontrados 10 táxons com o método QA (tabela 1) e valores semelhantes com os demais métodos (nove e oito táxons registrados com TA e

TM, respectivamente). Os métodos TM e QA apresentaram um único táxon exclusivo, que só foi registrado no respectivo método: Siphonaria pectinata em TM e Pinctada

imbricata em QA. No recife TBRA, o número de táxons encontrados foi maior com os

métodos TA (33 táxons). Com os métodos TM e QA, foi registrado apenas um táxon exclusivo em cada um deles (Gastropoda sp.1 e Stramonita spp., respectivamente), enquanto foram registrados sete táxons exclusivos pelo método TA (Achantochitona

ciroi, Aplysia dactylomela, Architectonica nobilis, Anachis lyrata, Petaloconchus varians, Tropiometra carinata, e Amphipholis squamata).

Recife TPRE Recife TBRA

TA TM QA Total TA TM QA Total Número de ordens 5 5 6 6 18 12 13 20

Número de famílias 9 8 9 9 30 21 24 32

Número de gêneros 9 8 10 10 33 23 27 37

Número de espécies 9 8 10 10 33 23 23 37

Número de espécies exclusivas 0 1 1 - 7 1 1 -

Os resultados das curvas de rarefação e extrapolação com a riqueza estimada de táxons, geradas a partir de randomizações (Figura 8), mostraram queno recife TPRE as riquezas de táxons registradas com os métodos TA e QA são equivalentes, com valores maiores que TM. Para o recife TBRA, os maiores valores foram obtidos com o emprego do método TA.

Com relação ao tempo despendido em campo para a aplicação de cada método (Tabela 2), as metodologias que utilizaram transectos com quadrados aninhados demandaram menor esforço em campo do que o método com uso de quadrados aleatório.

Tabela 1. Número total de táxons registrados nos recifes de Tipologia Platô Rochoso e Exposto (TPRE)

e de Tipologia com Blocos Rochosos e Abrigados (TBRA), em cada método testado. TA = transecto aleatório; TM = transecto em manchas; QA = quadrados aleatórios.

Figura 8. Curvas de rarefação (linhas contínuas) e extrapolação (linhas tracejadas) da riqueza

para cada método aplicado nos recifes estudados. Áreas pintadas em torno das linhas representam seus respectivos intervalos de confiança (0,95). TPRE = tipologia platô e exposto; TBRA = tipologia com blocos rochosos e abrigados. TA = transecto aleatório; TM = transecto em manchas; QA = quadrado aleatório.

Ri q u e z a (n ú m e ro d e e sp é cies) Recife TPRE Recife TBRA

Tempo aproximado de amostragem/m2 _(minutos) Tempo aproximado de amostragem/200m2 _(minutos) TA TM QA TA TM QA Recife TPRE 0,6 0,7 1 120 140 200 Recife TBRA 1 1 1,4 200 200 280 4. Discussão

O presente estudo mostrou que, nas duas tipologias de recifes areníticos tropicais estudados, o melhor método de levantamento de organismos bentônicos da mega e da macrofauna, com base nos moluscos e equinodermas, consiste no emprego de transecções aleatórias com quadrados aninhados, rejeitando nossa hipótese inicial de que a melhor abordagem seria dentro de manchas. Uma vez que as análises de similaridade indicaram que, independentemente do método adotado, a composição de táxons amostrada seria a mesma, pôde-se adotar o critério de escolha do método mais apropriado baseado na estrutura da comunidade observada, incluindo primariamente o critério de maior riqueza de táxons e o menor esforço de coleta.

No recife TPRE, as curvas de riqueza indicaram valores equivalentes para dados coletados com TA e com QA. No entanto, o uso de transecções confere vantagens sobre os quadrados, uma vez que aumenta a dimensão linear da área amostrada e detecta melhor os táxons raros, geralmente presentes em grande número e em baixas densidades em ambientes tropicais (por exemplo, Veras et al., 2013). Contempla também de melhor forma os táxons com superdispersão na abundância, táxons com distribuição agregada, como os ouriços da megafauna (Cordeiro et al., 2014) e táxons da macrofauna séssil, como Isognomon bicolor (Zamprogno et al., 2012). A porcentagem elevada de táxons raros detectada pelo método QA foi, na verdade, uma deficiência em se detectar a real ocorrência dos táxons Fissurelidae e Stramonita spp., registrados como frequentes nos demais métodos. Assim, infere-se que o uso de transectos contempla melhor a heterogeneidade ambiental das áreas estudadas.

Ainda, o uso de quadrados aleatórios aumenta a chance de a área amostrada ser totalmente dentro de áreas ocupadas ou ser entre áreas ocupadas. Essas duas situações