PLAN EXPERIMENTAL GENERAL

2.1.1 Approche globale

Tout au long de la thèse, le même plan expérimental a été suivi pour chaque expérience réalisée, comportant différentes étapes :

1. Définition des hypothèses biologiques

2. Prélèvement et dopage de la matrice d’exposition, préparation des chambres

d’exposition

3. Prélèvement ou élevage des organismes tests

4. Exposition des organismes aux matrices contaminées au laboratoire

5. Dosages des contaminants dans les différentes matrices

6. Modélisation et estimation des paramètres TK

2.1.2 Stratégies

Développer un cadre de modélisation TK générique appliqué aux invertébrés benthiques d’eau douce nécessite des tests sur diverses espèces et contaminants. Pour cela, différentes hypothèses sont émises pour que le cadre de modélisation s’adapte à n’importe quel couple espèce/contaminant. Les designs expérimentaux ont donc été adaptés en fonction des hypothèses à tester, comme développé dans cette section.

Choix des organismes tests

Le choix s’est initialement porté sur trois phylum, représentant des habitats (voies

d’exposition) et des capacités métaboliques a priori différentes : une larve d’insecte

(Chironomus riparius), un crustacé amphipode (Gammarus fossarum) et un mollusque (Radix auricularia). En effet, le chironome au stade larvaire (L4 notamment) vit la plupart du temps dans le sédiment, alors que le gammare et le radix sont des organismes épibenthiques. Le choix du chironome permet d’émettre l’hypothèse du sédiment comme voie d’exposition majoritaire et de considérer la croissance comme processus de dilution de la contamination. La sélection du gammare permet de considérer différentes voies d’exposition (eau, litière et/ou sédiment), et celle du radix uniquement par l’eau et/ou le sédiment.

Choix des substances et leurs concentrations d’expositions

Le PCB 153 fait ici office de composé de référence. La concentration d’exposition des

concentration a été choisie en se basant sur des valeurs de concentrations retrouvées dans les sédiments européens, présentée section 1.1.4 du Chapitre 1, et en anticipant les pertes éventuelles lors du dopage.

L’hexabromocyclododécane (HBCD) est un retardateur de flamme ayant un potentiel de bio-isomérisation γ- en α-HBCD chez les invertébrés (section 1.1.4). La concentration

nominale d’exposition par le sédiment sélectionnée est de 20 ng g-1 ps, en cohérence avec les

teneurs environnementales énumérées en section 1.1.4 du Chapitre 1.

Le 2,2′,4,4′,5-pentabromodiphényl-éther (BDE 99) est également un retardateur de flamme, suspecté d’être métabolisé en un composé moins bromé, le BDE 47 (section 1.1.4 du Chapitre 1). Le test gammare impliquant cette substance vise à tester cette hypothèse, où la

concentration souhaitée d’exposition des organismes au sédiment contaminé est de 6 ng g-1

ps, comme le suggère la valeur seuil indicative.

Enfin, le pyrène a été choisi également pour tester le processus de biotransformation en son métabolite majoritaire, le 1-OH-pyrène, chez le gammare (section 1.1.4 du Chapitre 1).

La concentration nominale d’exposition des organismes dans le milieu est de 80 ng g-1 ps, en

cohérence avec les teneurs environnementales présentées en section 1.1.4 du Chapitre 1.

Hypothèses testées

Du fait des propriétés hydrophobes des contaminants organiques sélectionnés, différentes voies d’exposition trophique ont été testées afin d’étudier leur contribution respective. Une voie d’exposition commune, le sédiment, a été testée pour toutes les expérimentations réalisées lors de ce projet. En complément, une exposition par les feuilles a également été testée pour le gammare (excepté dans le cas de l’exposition à l’HBCD du fait des résultats obtenus pour le PCB 153 et le BDE 99), afin de recueillir des données permettant d’estimer les taux d’ingestion (IR) de cette espèce. Ainsi, au maximum trois voies d’exposition (eau, sédiment, feuille) et trois voies d’élimination (excrétion, croissance,

Tableau 7. Résumé des expériences réalisées au cours de cette thèse.

Contaminant PCB 153 HBCD BDE 99 Pyrène

Espèce Chironome Gammare Radix Chironome Gammare Gammare Radix Gammare

Hypothèse de voie de contamination Sédiment et eau Eau, feuilles et sédiment Eau et

sédiment ^{Eau et sédiment}

Eau, feuilles et sédiment Eau et sédiment Eau, feuilles et sédiment Durée totale

l’expérience ^{7 jours 14 jours 18 jours 4 jours 18 jours 14 jours 18 jours 14 jours} Durée de

l’exposition ^{7 jours 7 jours 9 jours 4 jours 9 jours 7 jours 9 jours 7 jours} Durée de la

dépuration ^{- 7 jours 9 jours - 9 jours 7 jours 9 jours 7 jours}

Matrice dopée

Sédiment ^{Feuilles et}

sédiment ^{Sédiment Sédiment}

Feuilles et sédiment Sédiment Feuilles et sédiment Concentration nominale ^{100 ng g} -1 ps ^{75 ng g} -1 ps ^{20 ng g} -1 ps 6 ng g-1 ps ^{80 ng g} -1 ps

Objectif Validation du cadre de modélisation et

d’inférence ^{Bio-isomérisation Biotransformation}

2.2 PRELEVEMENT ET DOPAGE DE LA MATRICE D’EXPOSITION

2.2.1 Prélèvement, stockage et dopage des sédiments

Prélèvement et stockage

Le sédiment utilisé pour les expérimentations a été prélevé dans le parc de Miribel-Jonage. Cette zone de prélèvement est située en amont de l’agglomération lyonnaise, à proximité des champs de captage d’eau potable de Crépieux Charmy. Cette zone est

considérée comme une zone propre (Tableau 8), et les sédiments recueillis ont donc été

considérés comme non contaminés. Deux localisations ont été retenues pour le prélèvement :

- A l’étang des Libellules, situé aux coordonnées géographiques 45°47’55’’N

4°59’27’’E. Ce sédiment a uniquement été utilisé pour l’expérience des chironomes exposés au PCB 153.

- Dans un cours d’eau phréatique peu profond, le Rizan, situé à la position GPS

45°47'49.5"N 5°00'18.0"E. Selon les données du réseau de contrôle de surveillance national (Eau France 2015) la rivière du Rizan présente un bon état écologique et

chimique en 2015 (Tableau 8). Ce sédiment a été utilisé pour l’ensemble des autres

Tableau 8. Etat des eaux de la station « Rizan à Meyzieu » (code station : 06082510). Etat biologique : TBE : très bon état ; BE : bon état ; Ind : État indéterminé : absence actuelle de limites de classes pour le paramètre considéré, ou absence actuelle de référence pour le type considéré (biologie), ou données insuffisantes pour déterminer un état (physicochimie). Etat chimique : Ind : Information insuffisante pour attribuer un état. © Eau France (2015).

Trois semaines avant le début des expérimentations, un volume d’environ environ 60 L de sédiment est prélevé à l’aide d’une drague manuelle en acier inoxydable (Schiavone et Coquery 2010). Les premiers centimètres de la surface du sédiment sont ainsi collectés puis tamisés à 2 mm au-dessus de bidons en polypropylène (PP) afin de retirer les plus gros

organismes (e.g. les corbicules) et les éventuels débris de végétaux (Figure 26). Les bidons

sont stockés dans une chambre froide à 4°C pour une décantation d’au minimum 48 h avant utilisation.

Figure 26. Tamisage du sédiment (à gauche) ; site de prélèvement à l’étang des

Homogénéisation et dopage

Le jour du dopage, l’excès d’eau dans le bidon est prélevé par siphonnage si nécessaire, puis le sédiment est homogénéisé à l’aide d’une perceuse électrique munie d’une hélice à

peinture pendant 20 minutes (Figure 27).

Une fois le sédiment homogénéisé, on le répartit dans des bouteilles de verre (2 L, Pyrex) en versant 1,2 à 1,4 L de sédiment dans chaque bouteille (soit environ 2 kg de sédiment frais). Dans chacune des bouteilles a été ajouté un aliquot de la solution de dopage (préalablement mise sous agitation magnétique) pour atteindre la concentration souhaitée (cf.

Tableau 7). Un sédiment témoin solvant est également préparé, où le même volume de

solvant utilisé dans la solution de dopage (acétone) est ajouté. Les bouteilles contenant le

sédiment sont ensuite mises à agitation horizontale (Figure 27) pendant 24 h à 12 rpm

(50 Hz) afin d’homogénéiser la contamination sans impacter la composition du sédiment. Les bouteilles sont par la suite mises à décanter en chambre froide pendant 72 h. Une semaine avant le début de l’expérience, les sédiments dopés ont été homogénéisés de nouveau 20 minutes puis répartis dans les aquariums en PP (38 x 20 x 24.5 cm).

Préparation des solutions de dopage

Les différents contaminants et solvants utilisés pour le dopage ont été achetés à Sigma-Aldrich (St Quentin-Fallavier, France). Le PCB 153 est pur à 99.9 %, la somme des isomères

HBCD (∑HBCD) à 95 %, le BDE 99 et le pyrène à 99 %. L’acétone utilisée est de grade

HPLC.

Figure 27. Homogénéisation du sédiment à l’aide d’une hélice à peinture rattachée à

une perceuse électrique (gauche) ; système d’agitation pour le dopage du sédiment et des feuilles (droite).

PCB 153

A partir de la poudre PCB 153, une solution à 1,01 g L-1 est préparée dans l’acétone.

Pour l’exposition des chironomes et gammares, en ajoutant 75 μL de cette solution par

bouteille de sédiment frais, une concentration nominale de 50 ng g-1 pf est attendue dans le

sédiment s’il n’y a aucune perte (adsorption du contaminant sur les parois des bouteilles par

exemple), soit environ 100 ng g-1 ps.

Pour l’exposition des radix, comme il s’agit d’une exposition à un mélange par simplicité d’analyses chimiques (PCB 153 et BDE 99), seulement 50 μL de la solution à

1,01 g L-1 sont ajoutés dans chaque bouteille de sédiment frais afin de diminuer légèrement la

concentration d’exposition (soit environ 75 ng g-1 ps sans perte).

HBCD

A partir de la poudre ∑HBCD, une solution à 0,5 g L-1 est préparée dans l’acétone. En

ajoutant 71,6 μL de cette solution par bouteille de sédiment frais, une concentration nominale

de 10 ng g-1 pf est attendue dans le sédiment sans perte (soit environ 20 ng g-1 ps).

BDE 99

À partir de la poudre de BDE 99, une solution à 0,1 g L-1 a été préparée dans l’acétone.

Le sédiment a été contaminé en ajoutant 72 μL de cette solution par bouteille. La

concentration nominale de 3 ng g-1 pf devrait être atteinte sans les pertes éventuelles

(correspondant environ à 6 ng g-1 ps).

Pyrène

À partir de la poudre de pyrène, une solution-mère à 1 g L-1 a été préparée dans

l’acétone. Le sédiment a été contaminé à partir de cette solution. En ajoutant 160 μL de la

solution à 1 g L-1 par bouteille de sédiment, la concentration nominale de 65 ng g-1 pf devrait

être atteinte sans les pertes éventuelles (170 ng g-1 ps).

Préparation des aquariums tests

Environ 3 L de sédiment (contrôle ou contaminé) sont ajoutés dans chaque aquarium, auxquels sont ajoutés délicatement 15 L d’eau de forage (eau souterraine). Le temps d’équilibration du sédiment dans les aquariums est de 7 jours minimum avant l’introduction des organismes pour le début des tests, permettant une reformation des couches oxique et anoxique. L’équilibration se fait dans un bain thermostaté à la température d’exposition (Figure 28).

2.2.2 Prélèvement, stockage et dopage des feuilles

Prélèvement et stockage

Les feuilles ont servi de nourriture pour les gammares (conditions témoins et contaminées). Les feuilles d’aulne (Alnus glutinosa) sont prélevées sur un site a priori propre

une fois par an à l’automne (Figure 29) dans la commune des Ardillats (69430). Elles sont

ensuite mises à sécher pendant une semaine et conservées dans des bacs avant utilisation. Pour ces expérimentations, le lot de feuilles d’aulne récoltées en 2016 a été utilisé.

Dopage

Pour le dopage des feuilles avant le début de l’expérimentation, plusieurs lots de feuilles ont été pesés (entre 5 et 15 g ps en fonction de l’expérience et du nombre de gammares par aquarium) avant de les réhydrater avec de l’eau de forage pendant 4 jours dans des seaux. L’eau a été renouvelée tous les 2 jours. Par la suite chaque lot de feuille est transféré dans des bouteilles en verre de 2 L, auxquelles sont ajoutés 1 L d’eau de forage et la solution dopante. Les bouteilles sont ensuite doucement agitées horizontalement pendant 72 heures à 8 rpm. L’eau des bouteilles contenant de l’acétone et potentiellement contaminée est

Figure 29. Collecte des feuilles d’aulne par l’équipe Ecotox d’Irstea.

Couche oxique Couche anoxique

Figure 28. Reformation des couches oxique et anoxique après une semaine de

vidée dans les bidons de déchets appropriés à Irstea. Puis les bouteilles sont remplies de nouveau par de l’eau de forage propre pendant deux jours sans agitation afin d’éliminer toute trace d’acétone et ainsi éviter toute influence du solvant sur l’appétence pour les gammares. Pour chaque expérience, une condition témoin solvant (acétone) a été ajoutée pour vérifier l’impact de la contamination de disques de feuilles par de l’acétone sur l’appétence pour les gammares.

Solutions de dopage

Pour le dopage des feuilles (5 g ps) au PCB 153, un volume de 200 mL d’une solution à

5 μg L-1 dans l’acétone est ajouté à 1 L d’eau. On souhaite obtenir une concentration

nominale de 50 ng g-1 pf dans les feuilles d’aulne (environ 250 ng g-1 ps).

Pour le dopage des feuilles (10 g ps) au BDE 99, un volume de 15 mL d’une solution à

10 μg L-1 dans l’acétone est ajouté à 1 L d’eau. On souhaite obtenir une concentration

nominale de 3 ng g-1 pf dans les feuilles d’aulne (environ 15 ng g-1 ps).

Préparation des aquariums tests

Les feuilles témoins et contaminées sont ajoutées dans chaque chambre d’exposition

quelques minutes après l’introduction des gammares (Figure 30).