O pH da superfície de todas as membranas apresentaram valores entre 5,60 a 6,47, não havendo diferença significativa (p < 0,05) entre elas. Sendo assim, o pH de todas as membranas preparadas ficaram abaixo de 7,0, condições ideais para aplicação na cavidade oral. Tendo em vista, que as condições fisiológicas humanas normais da cavidade oral apresenta um pH variando de 5,5 a 7,0 (PATEL; LIU; BROWN, 2012).
O pH ácido ou básico extremos das membranas podem promover irritação da mucosa e causar desconforto ao paciente (KHAN et al., 2016). Além disso, a presença de alguns componentes no sistema e sua natureza química podem influenciar no pH das membranas formadas (NAIR et al., 2013). Entretanto, as membranas de quitosana
compostas por TA e seus agentes solubilizantes desenvolvidas, apresentaram resultados de pH próximo da neutralidade, na qual a adição desses componentes não interferiram no potencial hidrogeniônico do sistema. Desta forma, estes sistemas não provocariam desconforto ao paciente.
5.2.5 Ensaio de Tração (propriedades mecânicas)
As propriedades mecânicas das membranas foram avaliadas através da capacidade de resistir a ruptura e também de se alongar sob uma determinada tensão. A adição dos componentes ao sistema de formação da membrana de quitosana promoveu numericamente um aumento de força de ruptura necessária para romper a membrana, ou seja, os sistemas de II a VI ficaram mais resistentes a partição quando comparado com o sistema I (controle). Embora apenas entre as formulações I e IV; III e IV apresentou-se diferença estatística significativa entre elas, mostrado na tabela 7. A amostra IV foi a membrana mais resistente precisando de 94,16 N de força para sua ruptura, já a amostra controle precisou de 71,02 N.
Em relação ao percentual de elongação, o comportamento foi inverso, as membranas de II a VI apresentaram numericamente um percentual de alongamento menor do que a membrana controle. E assim como na força de ruptura, no alongamento apenas algumas membranas apresentaram diferenças estatísticas significativas entre si, mostrado na tabela 7. A membrana que apresentou o menor percentual de elongação (10,89%) foi a composta pelo fármaco somado ao solubilizante βCD, enquanto que a membrana controle atingiu um maior percentual de elongação (23,44%).
Tabela 7: Propriedades mecânicas das membranas de quitosana (n=6)
SISTEMAS MEMBRANAS
FORÇA DE RUPTURA ELONGAÇÃO
N DP % DP I Controle 71,02a 8,46 23,44a 4,61 II TA 89,39 13,80 17,56 3,76 III TA + βCD 73,50b 8,05 10,89ab 3.00 IV TA + HPβCD 94,16ab 12,10 18,06 5,07 V TA + HPβCD + TEA 1 81,05 4,94 20,65bc 5,97 VI TA + HPβCD + TEA 2,5 83,00 14,45 11,39ac 5,96 a-c
Diferentes sobrescritos na mesma coluna indicam diferenças significativas entre as membranas (p<0,05). DP = Desvio padrão.
Neste estudo foi observado com a adição dos componentes no sistema comportamentos relativamente distintos, embora obtidos valores de tensão de ruptura e alongamento muito próximos entre si. Os sistemas que tinha a TA e CD, apresentaram uma maior resistência à tensão de ruptura e um menor alongamento quando comparado com a membrana de quitosana controle. Fato também observado por pesquisadores quando adicionaram extrato de curcumina aos filmes de quitosana, aumentando a tensão de ruptura, provavelmente devido a uma interação da curcumina com as moléculas de quitosana (KALAYCIOĞLU et al., 2017). Assim, possivelmente as CDs que ficaram dispersa no meio da matriz polimérica, tenham interagido com as moléculas de quitosana estabelecendo uma ligação intermolecular e aumentando a resistência da membrana quando comparado com a membrana controle. Entretanto, com o sistema III (βCD e TA) apresentou uma menor força de ruptura e menor percentual de elongação, possivelmente em decorrência da incompleta dispersão dos componentes na preparação da membrana e o aumento da quantidade de soluto no sistema, respectivamente. Provavelmente, isto tenha levado a uma redução da interação desta ciclodextrina com a estrutura da quitosana.
A adição da TEA ao sistema ternário promoveu uma leve redução desta tensão da ruptura das amostras comparados com os outros sistemas, porém com uma diminuição do alongamento mais acentuado no sistema contendo a TEA 2,5%. Esse comportamento pode ser atribuído ao aumento do preenchimento dos espaços entre as cadeias poliméricas, consequentemente aumentando o distanciamento e impedindo a mobilidade entre as cadeias poliméricas. Este efeito leva a diminuição da flexibilidade e a rigidez da membrana deixando-a um pouco mais quebradiças. Fenômeno parecido observado por pesquisadores que desenvolveram membranas de quitosana incorporados com nanopartículas de enxofre (SHANKAR; RHIM, 2018).
Contudo, na adição de um plastificante, tem-se as propriedades mecânicas invertidas, pois a adição de moléculas de glicerol de tamanho reduzido, preenchem os espaços poliméricos e enfraquecem as interações das cadeias, aumentando o alongamento e reduzindo a resistência à tração (PRIYADARSHI et al., 2018). As propriedades mecânicas de membranas de quitosana dependem de diversos fatores, como o meio ácido utilizado, características e origem da quitosana, porcentagem e características dos componentes das formulações (plastificantes, reticulantes, dentre outras), como também de condições experimentais (SÁNCHEZ-GONZÁLEZ et al., 2010). Diante disso, na literatura não existe
um valor padrão para as características mecânicas da membrana de quitosana, devendo esses valores se adequarem as necessidades de sua aplicação e uso.
5.2.6 Estudo de intumescimento
A determinação do intumescimento das membranas de quitosana foi realizado em PBS com pH 6,8. Após imersão das membranas nesta solução foi possível observar um aumento de mais de 150% do seu peso inicial nos 30 minutos iniciais. Com o passar do tempo, o percentual foi aumentando para todas as membranas, mantendo o seu grau máximo de intumescimento. De acordo com a análise de variância, houve diferença signicativa (p-valor<0,05) entre as porcentagens de intumescimento dos perfis das membranas entre si, observando que as membranas com o sistema ternário apresentaram o maior grau de intumescimento quando comparado com as demais. Enquanto que, as membranas contendo a TA (sistema II) e a membrana controle (sistema I) tiveram o menor grau de intumescimento, conforme pode ser evidenciado na Figura 17.
Figura 17:Perfil de intumescimento em função do tempo das membranas de quitosana em meio PBS (n=5) 0 3 6 9 12 15 18 21 24 100 120 140 160 180 200 220 240 260
Intumesc
imento
(%)
Tempo (h)
I-Controle II-TA III-BCD+TA IV-HPBCD+TA V-HPBCD+TEA1+TA VI-HPBCD+TEA2,5+TAA quitosana é um polissacarídeo que possui um comportamento de intumescimento devido ao relaxamento das cadeias poliméricas quando em meio aquoso. A intumescência é uma propriedade importante para liberação de fármacos através da modulação de sua liberação (KHAN et al., 2016). Nas membranas de quitosana realizadas neste estudo observou-se um intumescimento maior no sistema ternário com a concentração de trietanolamina a 2,5%, gerando um grau de intumescimento em torno de 240%, sendo 100% maior que a membrana de quitosana controle. Este fato pode ser explicado pela presença da HPβCD juntamente com a TEA, que por apresentarem grupamentos polares aumentam a capacidade hidrofílica da matriz polimérica quando em contato com o meio aquoso (PALMA et al., 2009). O maior afastamento entre as cadeias poliméricas da quitosana acaba enfraquecendo suas ligações intermoleculares (BATISTA et al., 2019). Desta forma, pode facilitar a liberação dos compostos presentes em suas cadeias.
Em um estudo com filmes de quitosana contendo propilenoglicol, metronidazol e levofloxacino, verificou-se que com uma maior concentração do plastificante permitiu um maior grau de intumescimento (KHAN et al., 2016). O mesmo não acontecendo com a adição de microemulsões de óleo de canela e/ou soja, que gerou filmes de quitosana com baixo grau de intumescimento quando comparado com sua membrana controle, pois com o aumento do óleo no filme aumentou também a hidrofobicidade e consequentemente, reduziu a intumescência dos filmes (MA et al., 2015).
Diante do exposto, as membranas de quitosana de TA com as CDs desenvolvidas neste trabalho, como apresentaram um aumento no volume de intumescimento, sugere-se que estes sistemas possam ter uma liberação facilitada e aumentada quando em meio aquoso.
5.2.7 Análise de espectroscopia na região de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR)
A espectrofotometria por infravermelho das membranas de quitosana com a TA apresentaram espectros semelhantes com as bandas características do fármaco e do polímero, identificados com suas bandas específicas, como mostrado nos espectros da figura 18-C. Através da estrutura química da TA, na figura 18-B, é possível identificar os grupamentos principais no seu espectro, através do pico de 1050 cm-1 referente ao alongamento vibracional de C-F, da deformação axial de éter C-O-C em 1247 cm-1,
carbonila e o grupo O-H na faixa de 3523-3212 cm-1. Entretanto, nos espectros das amostras das membranas (II a VI), observou-se alguns grupamentos da TA com menor intensidade (como, o C-F e C=C) e também o desaparecimento ou sobreposição de algumas bandas, como C=O e C-O-C, quando comparados com o espectro do fármaco puro.
Figura 18: (A) estrutura química da quitosana; (B) estrutura química da TA; (C) espectros de FTIR-ATR da TA isolado, CH e das membranas, sendo, I: controle; II: TA; III: TA- βCD; IV: TA-HPβCD; V: TA-HPβCD-TEA 1%; VI: TA-HPβCD-TEA 2,5%
Fonte: autoria própria.
Os espectros das membranas de quitosana apresentaram as bandas características da amostra de quitosana em pó (CH), com a ajuda da sua estrutura química disponibilizada na
figura 18-A, percebe-se a identificação dos grupos químicos específicos com suas bandas presentes no seu espectro, como as bandas de absorção na região de 1655 cm-1 com estiramento C=O (amida I), na região de 3450 cm-1 referente ao estiramento OH ligado ao grupamento amina, a qual aparece sobreposta à banda de estiramento N-H. Além destas, no espectro da quitosana tem-se a presença da deformação angular de N-H (entre 1583 a 1594 cm-1) e a deformação axial de C-N de grupos amino (1308 a 1380 cm-1), que estão destacadas na figura 18. Todavia, as bandas características da quitosana aparecem de forma mais acentuada e sem deslocamentos dos picos nas amostras das membranas de quitosana (II a VI).
Os espectros de infravermelho com reflexão total atenuada foram utilizados para verificar possíveis interações entre os componentes (WANG et al., 2013). Além disso, as mudanças de frequência e intensidade das bandas podem indicar a formação de ligação químicas e complexação entre os componentes dos sistemas desenvolvidos (GRANERO; GARNERO; LONGHI, 2003) Na Figura 18 mostra que as membranas apresentaram bandas atribuídas à TA, corroborando com a compatibilidade com os demais componentes do sistema, porém, observou-se redução de intensidade e nitidez dos grupamentos característicos da TA. Isso pode ser provavelmente em decorrência da complexação do fármaco com as CDs, mesmo na presença da TEA, fato também observado em outros estudos que introduziram a TEA na complexação do sulfisoxazol com a HPβCD (GRANERO; GARNERO; LONGHI, 2003). Ou devido a presença de algumas moléculas de TA livre (não complexada com CDs) sendo responsável pelo baixo sinal de bandas características do fármaco. Já em outro estudo, a intensidade das bandas de infravermelho da TA e polímero foi reduzida nos espectros da nanosuspensão (GARCÍA-MILLÁN; QUINTÁNS-CARBALLO; OTERO-ESPINAR, 2017). Por outro lado, pequenos e discretos deslocamentos de bandas foram apresentados em outros estudos, como na incorporação de metronidazol e levofloxacino em filmes de quitosana para tratamento de periodontites (KHAN et al., 2016) e também quando foi incorporada a TA em pomadas e cremes (METTU et al., 2017). A quantidade elevada da quitosana nas membranas obtidas é muito maior que os demais componentes, desta forma, as bandas características desse polímero tem uma tendência a sobrepor as demais bandas dos demais componentes, principalmente do fármaco que se encontra em bem menor quantidade.
5.2.8 Estudo da cristalinidade por difração de raios X (DRX)
A quitosana de média massa molecular apresentou dois halos cristalinos com base larga em 2θ = 10° e 2θ= 20° que são característicos deste (SANTOS et al., 2019). A cristalografia da TA apresentou picos agudos na faixa de 2θ = 9 – 30°, destacando os picos no 2θ = 9,9, 14,6, 17,6 e 24,7, caracterizando a estrutura cristalina do fármaco (GARCÍA- MILLÁN; QUINTÁNS-CARBALLO; OTERO-ESPINAR, 2017). Enquanto que nas membranas, os picos cristalinos da TA não aparecem. Todos os sistemas apresentaram difratograma semelhantes, sem cristalinidade e totalmente amorfa, como mostrado na figura 19.
Figura 19: Difratograma 2θ da CH, TA e das membranas, onde, I: Controle; II: TA; III: TA-βCD; IV: TA-HPβCD; V: TA-HPβCD-TEA 1%; VI: TA-HPβCD-TEA 2,5%
A quitosana possui um perfil semicristalino devido a fortes ligações químicas intra e intermoleculares em decorrência dos grupos funcionais (amina, amida e hidroxila) pertencentes à sua estrutura química (SANTOS et al., 2019). No processo de obtenção das membranas é comum ocorrer a amorfização do seu estado, fato este observado quando comparado a cristalografia da quitosana na forma de pó com a que foi feita no filme de quitosana sem componentes (controle), podendo ocorrer uma redução de intensidade do seu pico de cristalinidade ou até o seu desaparecimento no 2θ = 10° e 20°, assim como observado por outros pesquisadores (CUI et al., 2018; SANTOS et al., 2019; TRASTULLO et al., 2016; WANG et al., 2016). A ausência dos picos cristalinos referentes a TA nos difratogramas das membranas de quitosana aqui estudadas permite sugerir que essas formulações promovem a amorfização dos componentes que o compõem, resultado experimental semelhante também encontrado por outros pesquisadores quando desenvolveram filmes de quitosana com amido de arroz para incorporação de própolis, mas que neste tipo de formulação além da amorfização, também afetou as propriedades mecânicas dos filmes (SURIYATEM et al., 2018).
Entretanto, o processo de complexação de inclusão das CDs, principalmente a HPβCD, com a TA pode também promover a amorfização do perfil cristalino deste fármaco dentro das membranas, corroborando com o perfil dos espectros mostrados dos sistemas (III ao VI). Outros trabalhos tem revelado esse mesmo comportamento de amorfização do perfil cristalino do fármaco quando complexado com a CDs, como no caso da complexação da ropivacaína com HPβCD (DE ARAUJO et al., 2008), e na complexação de um derivado de etilenodiamina da βCD com nanopartículas magnéticas revestidas com quitosana contendo ácido acrílico (ANIRUDHAN; DIVYA; NIMA, 2016).
Em outro estudo, pesquisadores concluíram que a largura do pico atribuído ao filme de quitosana era maior do que o mesmo pico obtido a partir da quitosana em pó, indicando uma porcentagem de quitosana menos cristalina. Portanto, os grupamentos hidrofílicos do polímero estão disponíveis para absorção de água em contraste com a morfologia cristalina (WANG et al., 2016). Desta forma, com a redução da cristalinidade das membranas, aumentam a afinidade pela água, e como consequência eleva a propriedade de intumescimento destes sistemas.
5.2.9 Análise térmica (DSC e TG/DTG)
Os termogramas de DSC da TA, CH e das membranas de quitosana com os componentes são mostrados na Figura 20. Na curva da TA observa a presença de um evento endotérmico de degradação em 292 °C. Nas demais curvas mostrada na figura 20, evidencia a presença de dois eventos térmicos, o primeiro endotérmico próximo de 100 °C, podendo ser atribuído à perda de água presente nas membranas e o segundo exotérmico em torno de 300 °C, podendo estar relacionado a degradação da quitosana.
Figura 20: Termogramas de DSC da TA, CH em pó e das membranas de quitosana onde, I: Controle; II: TA; III: TA-βCD; IV: TA-HPβCD; V: TA-HPβCD-TEA 1%; VI: TA- HPβCD-TEA 2,5%
Fonte: autoria própria.
Na Tabela 8 é possível verificar os valores dos picos endotérmicos e exotérmicos e as entalpias relacionadas a cada pico das membranas. A membrana com apenas a TA (Sistema II) apresentou maior valor de energia no pico endotérmico (ΔH = -380,37 J/g). E a membrana contendo os multicomponentes, HPβCD e TEA 1% (sistema V) apresentou maior valor exotérmico (ΔH = 306,72 J/g). Enquanto que a membrana contendo a βCD
(sistema III) apresentou os menores valores entálpicos para os dois eventos (ΔH = -104,97 J/g e ΔH =191,32 J/g).
Tabela 8: Temperaturas de pico e alterações de entalpia obtidas pelo termogramas de DSC das membranas de quitosana
Sistemas Membranas
Temperatura (°C)
ΔH (J/g) T on set T end set T peak
I CH (controle) 51,10 146,71 98,37 -253,46 270,08 318,62 298,44 219,84 II CH-TA 30,11 152,37 84,34 -380,37 271,94 322,76 299,05 212,10 III CH-βCD-TA 43,49 146,64 92,24 -104,97 273,13 327,70 300,56 191,32 IV CH-HPβCD-TA 73,67 161,07 108,47 -108,98 275,09 337,41 300,40 297,24 V CH-HPβCD-TEA 1-TA 39,34 159,71 88,07 -292,69 268,63 324,72 298,73 306,72 VI CH-HPβCD-TEA 2,5-TA 46,14 155,80 93,95 -321,01 259,53 323,52 297,48 228,85
Fonte: autoria própria.
Nos termogramas apresentados na figura 21, também observa-se dois eventos térmicos, tanto na termogravimetria como na sua derivada, corroborando com os eventos encontrados nas análises de DSC. O primeiro evento da perda de massa das membranas acontece entre 50 e 100 °C sugerindo a volatilização da água presente nos sistemas, enquanto que o segundo ocorre em torno dos 300 °C, referindo-se a decomposição da quitosana. A curva da TA não aparece nos sistemas, provavemente pela quantidade reduzida e também sugerindo a sua complexação com as CDs. Na tabela 9 registra os valores da perda de massa em cada sistema desenvolvido em sua respectiva faixa de temperatura, na qual constatou que as membranas contendo solubilizante a TEA tiveram uma menor perda de massa em relação as demais membranas.
Tabela 9: Resultados termogravimetricos de decomposição das membranas de quitosana
Sistemas Membranas Eventos
Faixa de temperatura (°C) Massa (mg) Massa (%) Total perda de massa (%) I CH (Controle) 1° 26-198 0,84 16,26 68,85 2° 198-900 2,69 52,59 II CH-TA 1° 26-203 0,79 15,46 68,47 2° 203-900 2,71 53,01 III CH-βCD-TA 1° 26-209 0,83 16,06 70,76 2° 209-900 2,81 54,70 IV CH-HPβCD-TA 1° 26-219 0,79 15,64 69,43 2° 219-900 2,73 53,79 V CH-HPβCD-TEA 1-TA 1° 26-220 0,82 15,61 65,76 2° 220-900 2,63 50,15 VI CH-HPβCD-TEA 2,5-TA 1° 26-206 0,72 14,21 66,76 2° 206-900 2,67 52,55
Fonte: autoria própria.
As análises térmicas realizadas com as membranas em estudo revelaram duas etapas de decomposição térmica, na qual o primeiro evento sugere evaporação das moléculas de água ou volatilização de pequenas moléculas associados a grupos hidrofílicos presentes no sistema (em torno dos 100 °C) e o outro evento, em aproximadamente 300 °C, é atribuído provavelmente a desidratação dos anéis de sacarídeos, bem como a degradação das unidades acetiladas e desacetiladas da quitosana, fato também observados por outros pesquisadores (BOGGIONE et al., 2017; QIAO et al., 2017; ZHANG et al., 2018). Além disso, também foi possível observar uma perda de massa suave em torno de 15% no primeiro evento térmico e um percentual maior de perda (± 50%) no último evento, situação semelhante encontrada por outros pesquisadores, no processo de obtenção de membrana de quitosana com e sem sorbitol (LIU et al., 2014), na utilização de novas formas de dissolução e preparação de membranas de quitosana (CUI et al., 2018) e também no desenvolvimento de membrana com e sem glicerol (LECETA et al., 2013).
Figura 21: Termogramas (A) TG e (B) DTG da TA, CH em pó e das membranas de quitosana onde, I: Controle; II: TA; III: TA-βCD; IV: TA-HPβCD; V: TA-HPβCD-TEA 1%; VI: TA-HPβCD-TEA 2,5%
Fonte: autoria própria.
As curvas termogravimétricas das membranas de quitosana obtidas nesta pesquisa apresentaram um comportamento térmico muito semelhante entre si, situação também observada em outro estudo por pesquisadores, no desenvolvimento de membranas de quitosana com e sem açafrão (KALAYCIOĞLU et al., 2017). As membranas com a presença da TEA apresentaram um percentual de perda total de massa um pouco menor
(±95%) quando comparada com as outras membranas, promovendo uma melhor estabilidade térmica. O mesmo não aconteceu em outra pesquisa que adicionaram pó de casca de ovo no processo de obtenção de membrana de quitosana, na medida em que aumentava a concentração da casca na membrana, o percentual da perda de massa aumentava e consequentemente diminuía a sua estabilidade térmica (SANTOS et al., 2019).
Os resultados semelhantes obtidos por DSC e pelo TG/DTG entre as membranas estudadas sugere uma boa correlação a estabilidade das membranas, conferida provavelmente pela organização das redes poliméricas formadas, mesmo com a presença extra das CDs, TA e TEA nos sistemas.
5.3 METODOLOGIA DO DOSEAMENTO DA TA NOS SISTEMAS POR