Pistes de recherche

As soluções contendo os peptídeos de H-3, gerados por digestão com diferentes proteases, foram injetados em um sistema nanoAcquity (Waters Corp) conectado a uma fonte de nano electrospray de um espectrômetro de massas híbrido (SYNAPT HDMS – Waters Corp). O espectrômetro foi calibrado na faixa de m/z 50 a 1600 com os fragmentos do íon de [Glu1]-fibrinopeptídeo B. O analito foi aplicado em uma coluna de fase reversa C18 (75 µm x 100 mm) e os peptídeos foram eluídos através gradiente linear de 10% a 85% de ACN contendo AF 0,1%. O espectrômetro de massas operou em modo positivo na faixa de m/z 50 a 3000, sob voltagem do capilar de 3,0 kV e temperatura da fonte de 90 °C. As análises de LC- MS/MS foram conduzidas de acordo com a função DDA (Data Dependent Analysis _{– Análise} Dependente de Dados), sendo selecionados para análise de MS/MS íons precursores com carga (z) entre 2+ _{e 4}+_{. O lock mass utilizado durante a coleta de dados foi o íon de m/z 785,84} de [Glu1]-fibrinopeptídeo B Os íons selecionados foram fragmentados por CID (Collision Induced Dissociation), utilizando argônio como gás de fragmentação. Os espectros foram coletados e processados pelos programas MassLynx v4.1 e ProteinLynx v.2.4 (Waters Corp.). Os espectros de fragmentação CID foram interpretados manualmente pelo uso da ferramenta PepSeq.

3.16 Clonagem da cadeia α de H-3.

3.16.1 Extração de RNA

Espécimes da esponja H. caerulea foram coletados na praia do Pacheco, Caucaia, Ceará, e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. O material congelado foi armazenado em gelo seco e transportado até o laboratório.

A extração de RNA foi realizada com o kit para extração de RNA - RNAspin Mini RNA isolation kit (GE Healthcare). Toda a vidraria utilizada na extração de RNA foi previemente tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). 30 mg de esponja congelada foram macerados usando pistilo e homogeneizado com 350 µL do tampão de lise RA1 acrescido de

3,5 µL de -mercaptoetanol. A mistura foi centrifugada e transferida para uma coluna de oligodT, seguindo o protocolo determinado pelo fabricante.

Ao fim do processo de purificação, o RNA total foi armazenado a -80 oC.

A concentração de RNA foi estimada mediante quantificação através de absorbância a 260 nm.

3.16.2 Eletroforese em gel de agarose.

Para análise da integridade do RNA purificado foi realizada uma eletroforese em gel de agarose (SAMBROOK et al., 1989). O gel foi preparado utilizando agarose 2 % (p/v) diluída em solução de Tris-Borato-EDTA (TBE) 1x, a cuba foi preenchida com tampão de corrida e 5 µL de RNA acrescido de 2 µL de tampão de amostra foram aplicados. A corrida eletroforética foi realizada em 40 minutos e a tensão foi mantida constante em 60 V.

Ao fim da corrida eletroforética, o gel foi incubado durante 15 minutos em uma solução de brometo de etídio (0,5 g.mL-1). Após o período de incubação, as bandas foram visualizadas através de exposição do gel à iluminação ultravioleta utilizando um transluminador.

3.16.3 Síntese do DNA complementar

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado mediante reação da transcriptase reversa. A mistura da reação foi constituída de 12 µL de água tratada com DEPC (0,1% v/v); 10 l do oligonucleotídeo Qt (5'-CCA GTG AGC AGA GTG ACG AGG ACT CGA GCT CAA GCT T16-3'); e 1 µg de RNA total. A reação foi incubada a 70 oC durante 10 minutos e posteriormente mantida no gelo durante 5 minutos. Então, foram adicionados 4 uL de tampão 5X (first strand Promega), 2 uL de DTT 0,1 M, 1 µL de inibidor de ribonuclease (RNAsin 40 g/µL, Promega), 1 µL de dNTP (10 mM) e 200 unidades de transcriptase reversa (M-MLV RT- Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) (RNAse H Minus, Promega). O volume final foi ajustado, com H2O tratada com DEPC, para 20 µL. A reação foi mantida a 42 o_{C durante 1h, seguido por incubação a 50} o_{C por 10 minutos.}

3.16.5 Amplificação do produto 3’RACE de H-3

O oligonucleotídeo iniciador (HAL-1) foi desenhado a partir da sequência DGPVET obtida por MS/MS na cadeia _{α de H-3 e presente na ORF codificadora da lectina} putativa da esponja Amphimedon queensalndica.

Para a amplificação do cDNA foi realizada uma reação em cadeia da polimerase (PCR). A fita de cDNA foi usada como fita molde, HAL-1 foi utilizado como iniciador específico senso e Q1 (GAG GAC TCG AGC TCA AGC) foi utilizado como iniciador antisenso. 1/10 da reação da transcriptase reversa foi utilizado para a reação de amplificação, além de 10 M dos iniciadores (HAL_1 e Q0), uma unidade de Taq polimerase e 1 L de dNTPs (10 mM). A PCR foi realizada nas seguintes condições: desnaturação a 94 °C por 4 min, seguido de 30 ciclos de amplificação (94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s e 72 °C por 30 s) e extensão a 72 °C durante 10 minutos.

O produto da amplificação foi reamplificado em uma nested PCR utilizando o primer Q0 (CCA GTG AGC AGA GTG ACG), nas mesmas condições da PCR descrita acima.

Todos os produtos de PCR foram avaliados quanto ao tamanho e integridade por eletroforese em gel de agarose (1,2%).

3.16.6 Ligação do produto de amplificação ao vetor pGEM-T-easy

O fragmento amplificado, aproximadamente 500 pares de base (pb), foi ligado ao vetor pGEM-T easy. A reação de ligação foi preparada contendo 5 unidades da enzima T4 DNA ligase, 5 L de tampão de ligação (2x concentrado), 50 ng do vetor pGEM-T-easy (PROMEGA) e 12,5 ng de inserto, respeitando a proporção de 1:3 vetor/inserto.

3.16.7 Transformação de células competentes.

Placas de LB ágar contendo DH5_{α foram utilizadas para o processo de} transformação bacteriana. Uma colônia de DH5α foi transferida para um tubo contendo 200 L de 100 M CaCl2 e 10 L da reação de ligação. As células foram incubadas no gelo por 30 min, depois mantidos em banho-maria aquecido a 42 °C por 2 min e novamente mantidos em gelo por mais 2 min. Em seguida, 1 mL de meio SOC foi adicionado as bactérias transformadas e o cultivo foi mantido a 37 °C por 1 h, sob agitação branda de 100 rpm.

Para avaliação da transformação, 200 L de cultivo foram semeados em meio sólido SOB ágar contendo ampicilina (100 g.mL-1), 0,5 mM de IPTG e 40 g.mL-1 de X-Gal e incubada a 37 °C por 16 horas.

Os clones positivos (brancos) foram isolados da placa, crescidos em LB broth a 37 °C por 16 horas , estocados em glicerol e uma fração foi submetidos a PCR.

3.16.8 Purificação dos plasmídeos recombinantes e análise da sequencia do fragmento.

Os clones que tiveram a presença de inserto confirmada por PCR foram inoculados, a partir do estoque em glicerol, em meio LB líquido contendo ampicilina (100

g.mL-1) e incubados por 16 h a 37 °C sob agitação de 100 rpm.

Os plasmídeos contendo o inserto foram extraídos e purificados seguindo as recomendações do fabricante (QIAGEM).

Os plasmídeos foram sequenciados em sequenciador automático MegaBACE (GE Healthcare) . Os oligonucleotídeos iniciadores usados foram T7 promoter senso e SP6 promoter anti senso, que flanqueiam a região de inserção. As contigs referentes ao inserto foram analizadas com o auxílio do programa Phred-Phrap-Consed (EWING et al., 1998).