Pichia pastoris, una levadura no convencional emergente

S. cerevisiae ha sido históricamente la levadura más estudiada y caracterizada en la producción de proteínas recombinantes (Fidan and Zhan, 2015; Huang et al., 2017;

Baghban et al., 2019) y metabolitos (Lian et al., 2018). Además de ser el primer organismo eucariota en ser secuenciado (Goffeau et al., 1996), tiene el reconocimiento como organismo GRAS (generally regarded as safe) (Lian et al., 2018). Sin embargo, en los últimos años ha emergido el uso de levaduras alternativas a S. cerevisiae denominadas

como no convencionales debido al potencial que ofrecen en relación al requerimiento de nuevas rutas metabólicas para la ingeniería de la producción de metabolitos, perfiles de productos deseados y fisiología en general (Wagner and Alper, 2016).

Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Arxula adeninivorans, Hansenula polymorpha (Ogataea angusta), Kluyveromyces lactis, Candida albicans, C.

galbrata y Pichia pastoris (recientemente clasificada como Komagataella phaffii) son claros ejemplos de levaduras propuestas y ampliamente descritas en varios estudios (Çelik and Çalık, 2012; Kim et al., 2015; Wagner and Alper, 2016; Raschmanová et al., 2018; Rebello et al., 2018). Dentro de estos microorganismos, P. pastoris ha demostrado ser una excelente alternativa a las factorías convencionales previamente descritas (Gasser and Mattanovich, 2018).

P. pastoris, es una levadura metilotrófica aislada por primera vez en la región de Yosemite (California-USA) por la compañía Phillips Petroleum alrededor del año 1960, y utilizada en sus inicios para la producción a gran escala de proteína unicelular (SCP) debido a su capacidad de metabolizar el metanol. Sin embargo, la crisis del petróleo en el año 1973 incrementó el precio de dicho sustrato haciendo inviable la producción de SCP, por lo que la investigación para dichos fines fue abandonada (Ahmad et al., 2014). Años más adelante, Cregg et al. (1989) caracterizaron los genes responsables de la actividad alcohol oxidasa en P. pastoris, lo cual, hizo emerger nuevamente el uso de dicha levadura como factoría celular para la producción de proteínas recombinantes (Cregg et al., 1993).

Hasta el día de hoy, más de 5000 proteínas recombinantes han sido exitosamente producidas en esta factoría celular (Chang et al., 2018). Actualmente las cepas utilizadas de P. pastoris para la RPP provienen de la cepa NRRL Y-11430 del “Agriculture Research Service culture collection” (ARS) (Peoria IL, USA); la cual también fue depositada con código CBS7435 en el “Centraalbureau voor Schimmelcultures”

(Utrecht, The Netherlands) (Sturmberger et al., 2016). Dicha cepa dio lugar a los hospederos más conocidos para la expresión de proteínas recombinantes como son la cepa auxotrófica para histidina GS115 (his4) y la prototrófica X-33 (Küberl et al., 2011). Del mismo modo se han generado otras variantes de acuerdo a las necesidades de la plataforma de expresión, como ejemplo se pueden citar las cepas GS200 (his4, Arg4) auxotrófica para histidina y arginina, KM71 (his4 arg4 aox1Δ::ARG4) auxotrófica para histidina y con el gen AOX1suprimido,MC100-3 (his4 arg4 aox1Δ::ARG4 aox2Δ::Phis4) generada al suprimir los genes AOX1 y AOX2 , SMD1165 (his4 prb1) auxotrófica para

histidina y el gen PRB1 de la proteinasa B suprimido, SMD1168 (his4 pep4) auxotrófica para histidina y con el gel PEP1 de la proteinasa A suprimido, SMD1163 (his4 pep4 prb1) auxotrófica para histidina y con los genes PREP4 y PRB1 suprimido de entre otras (Juturu and Wu, 2018).

Tabla 2. Resumen de las principales ventajas de P. pastoris como sistema de producción de proteínas recombinantes (RPP).

Ingeniería genética

Herramientas de manipulación genética disponibles tales como:

- Amplia diversidad de promotores disponibles con diferente tipo de regulación:

Constitutiva, inducible, desreprimible (PGAP, PPGK, PFDH, PDAS1, PTHI11, PPYK,PSDH) (Periyasamy et al., 2013; Gasser et al., 2015; Landes et al., 2016; Juturu and Wu, 2018;

Massahi and Çalık, 2018).

- Edición génica a través del uso de tecnologías CRISPR/Cas9 (Raschmanová et al., 2018; Weninger et al., 2018) y tecnologías Cre-loxP (C. Li et al., 2017; D. Li et al., 2017)Disponibilidad de diversos péptidos señal que permitan incrementar la eficiencia en la secreción de proteínas recombinantes (Massahi and Çalık, 2016; Barrero et al., 2018).

- Generación de cepas recombinantes a través de recombinación homóloga (HR) y no homóloga (NHEJ) (Schwarzhans et al., 2016a, 2016b).

Procesamiento de proteínas

Capacidad de realizar modificaciones postraduccionales como:

- Ensamblaje y plegamiento de proteínas relativamente complejas, así como la formación de puentes disulfuros (Yang and Zhang, 2018).

- Capacidad de realizar glicosilaciones, con reducidas tasas de hiperglicosilación e hipermanosilación a diferencia de S. cerevisie, las cuales han sido reportadas como un gran desafío al momento de generar proteínas humanizadas, pues generan reacciones de inmunorechazo (Ahmad et al., 2014; Rebello et al., 2018). P. pastoris no muestra el mismo patrón de glicosilación de las células de mamífero, pero se ha conseguido ingenierizar los patrones de glicosilación con tal de humanizar las proteínas de interés.

Así, se han diseñado cepas comerciales capaces de producir proteínas humanizadas (Pichia Glycoswitch®, Biogrammatics) (Laukens et al., 2015).

- Capacidad de segregar eficazmente proteínas recombinantes con bajos niveles de proteínas nativas (García-Ortega et al., 2019).

Ingeniería de bioproceso

- Reconocimiento como organismo GRAS, debido a que carece de endotoxinas detectables. Además, cuenta con la aprobación de otras agencias reguladoras internacionales como: EMA, PMDA, CDSCO y CFDA (Vogl and Glieder, 2013; Love et al., 2018).

- Crecimiento no fermentativo en glucosa (conocido como efecto Crabtree-negative), el cual le permite mantener el metabolismo respiratorio bajo condiciones de exceso de fuente de carbono como glucosa en condiciones aerobias (Prielhofer et al., 2015).

- Crecimiento en medio definido llegando a altas densidades celulares por encima de 150 g L^-1 (Jahic et al., 2006).

- Capacidad de producción a gran escala en planta piloto (Zhao et al., 2008).

Las características que hacen a P. pastoris un sistema de expresión prometedor se resumen a continuación en la Tabla 2. Estas cubren diferentes campos como la ingeniería genética, el procesamiento de proteínas y la ingeniería del bioproceso.

Finalmente, cabe mencionar que, junto a las características previamente descritas, el creciente conocimiento del metabolismo de P. pastoris ha incrementado el interés en explorar dicho potencial con el objetivo de producir tanto metabolitos primarios como secundarios, lo cual ha abierto las puertas hacia el desarrollo de la ingeniería metabólica como un nuevo frente en la investigación sobre esta levadura (Peña et al., 2018).

1.3 Estrategias para a un desarrollo integrado de P. pastoris como plataforma