PICH-115 facilite l’interaction entre Tat et TAR

En voyant l’effet d’enrichissement du signal de liaison du mutant I39Q de Tat à l’ARN TAR en présence de PICH-115, nous voulions évaluer l’interaction entre TAR et les autres mutants de GST-Tat en absence et en présence de PICH-115. Dans cet essai, nous avons utilisé les délétions de GST-Tat suivantes : Δ2/36, où le domaine N- terminal, jusqu’au domaine central, est enlevé; Δ48, où le domaine C-terminal, à partir du domaine central, est enlevé; Δ37/47, où le domaine central est enlevé. Ces protéines tronquées sont comparées au GST-Tat TS dans la figure 20A, et on peut voir Figure 19. Test des anticorps de Super Shift (SS) contre PICH-115 et GST-Tat dans un EMSA TAR. Gels acrylamide natifs. Le panneau de gauche montre l’effet de l’ajout des anticorps au complexe ribonucléoprotéique. Le panneau de droite montre l’effet des anticorps sur l’ARN TAR seul. Les puits 1 et 5 ne contiennent aucun anticorps. Les puits 2 et 7 contiennent l’anticorps anti-GST. Les puits 4 et 8 contiennent l’anticorps anti-PICH115. Les puits 3 et 6 contiennent les anticorps anti- TAT et anti-HIP116, respectivement. La flèche sur le gel du panneau de gauche pointe vers un super shift observé sur la piste 2, avec l’anticorps anti-GST.

que, dans ces expériences, les protéines Δ2/36 et Δ37/47 qui contiennent toujours le motif de liaison à l’ARN interagissent le moins avec TAR en absence de PICH-115 (pistes 4 et 8, respectivement). Quant à Δ48, son association avec TAR (piste 6) est plus forte que les deux autres délétions, et l’enrichissement de son interaction avec TAR en présence de PICH-115 (piste 5) est aussi supérieur comparé aux autres délétions (pistes 3 et 7). Le profil d’interaction basale, c’est-à-dire en absence de PICH- 115, des ces différentes protéines tronquées suggère que la liaison de Tat dépend d’une conformation apportée par les domaines central et N-terminal, et non seulement du motif de liaison à l’ARN. Dans tous les cas de délétion, les complexes formés en présence de PICH-115 sont plus petits en taille que celui formé avec GST-Tat TS, ce qui était ce qu’on prévoyait. Cependant, dans les puits contenant Δ37/47 (pistes 7 et 8), on peut observer une trainée ou bien plusieurs complexes de tailles différentes, en présence et en absence de PICH-115, suggérant que la délétion génère plusieurs repliements différents qui forment des complexes avec des mobilités variées sur gel.

Figure 20. Comparaison des complexes formés avec l’ARN TAR et différents mutants de GST-Tat. Gels acrylamide natifs. A. Formation des complexes par GST- Tat TS et des versions de protéines tronquées et l’ARN TAR, en présence et en absence de PICH-115. B. Formation des complexes par GST-Tat TS et des versions de Tat avec des mutations ponctuelles et l’ARN TAR, en présence et en absence de PICH-115. Voir figure 13 pour plus d’informations sur les mutants de GST-Tat utilisés.

Le mutant L43A-G44A (figure 20B, pistes 11 et 12), que nous avons créé dans une région à l’intérieur du domaine central de la protéine Tat ayant une pseudo- homologie avec PICH-115, peut lier TAR autant que la protéine de type sauvage avec ou sans PICH-115. Cette observation était plus ou moins attendue puisque cette double mutation ponctuelle n’a jamais été caractérisée dans Tat comme étant inhibitrice de ses fonctions. Cependant, les mutants comme F38A, I39Q, K41A et S46P qui sont tous des mutations ponctuelles dans le domaine central de Tat, sont très bien connus pour inhiber la trans-activation du VIH (Dey et al., 2012; Ronsard et al., 2014; Kashanchi et al., 1994; Meyerhans et al., 1989). Ces mutations sont également celles qui interagissent très faiblement avec TAR quand elles sont seules avec l’ARN (figure 20B, pistes 6,8,9 et 14, respectivement). Toutefois, le signal du complexe Tat/TAR est presqu’aussi fort en présence de PICH-115 que celui avec GST-Tat TS pour les mutants K41A et S46P (figure 20B, pistes 9 et 13). Ces complexes se forment également à la même mobilité que celui avec le TS. Ceci montre que ces mutations ponctuelles peuvent affecter l’interaction entre TAR et GST-Tat seul sans nécessairement influencer leur interaction avec PICH-115 qui lui faciliterait leur encrage à TAR. D’autre part, comme constaté auparavant, la mutation I39Q lie TAR plus faiblement que la protéine TS et ce complexe Tat/TAR migre plus vite aussi (figure 20B, piste 7). Cette différence de mobilité est également observée avec la protéine mutée, F38A, qui génère une très faible trainée sur la piste de migration lorsqu’elle est seule avec l’ARN TAR (figure 20B, piste 5). En présence de PICH-115, on peut observer 3 bandes distinctes, toutefois migrant toutes les trois plus bas que le complexe formé par GST-Tat TS. Ceci pourrait suggérer que le mutant F38A de Tat subit des changements de conformation, en présence et en absence de PICH-115, alors qu’il essaie de former un complexe avec TAR, laissant ainsi plusieurs bandes sur gel. Une des observations qui mérite attention est celle du complexe ribonucléo-protéique formé par GST-Tat C22G et TAR (pistes 3 et 4). Cette mutation dans le domaine activateur, en amont du domaine central, abolit l’interaction physique de Tat avec Cycline T1 en perdant son capacité de lier des ions de zinc qui gardent les deux protéines ancrées l’une à l’autre (Garber et al., 1998). Ce mutant qui, ici, ne lie presque pas du tout TAR seul, est assisté par la présence de PICH-115 pour former un

complexe nucléoprotéique avec un facteur d’enrichissement de signal = 4. L’association de Tat à l’ARN TAR nécessite bien sûr le motif riche en arginine, donc le domaine basique, cependant il nécessite également des résidus retrouvés dans les autres régions de la protéine Tat pour assurer une conformation stable qui maintient l’interaction de la protéine avec les acides ribonucléiques (Tahirov et al., 2010). La mutation ponctuelle C22G est importante pour la liaison de Tat à TAR, puisque seule la protéine n’est point capable de lier TAR (figure 20B, piste 4), et le fait que l’addition de PICH-115 montre une augmentation de liaison suggère que PICH-115 encourage l’adoption d’une conformation de Tat qui favorise son interaction avec TAR.

2.2.2.5 Les activités enzymatiques de PICH-115 ne sont pas requises pour l’enrichissement